四种大肠埃希氏菌的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学和食品安全检测领域，具体为四种大肠埃希氏菌的检测试 剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 生鲜食品如果蔬类、肉禽类、海产类及其加工产品中普遍存在大肠埃希氏菌，大肠 埃希氏菌是一种条件致病菌，在普通情况下是动物大肠的主要互生菌，对调节人体肠道菌 群平衡，促进大肠对维生素的吸收有重要的积极作用。但一些发生了基因变异的大肠埃希 氏菌会产生毒素，危及人类健康，甚至引发大规模的传染性疾病。传统检测大肠埃希氏菌的 方法采用细菌培养、分离、鉴定等一系列步骤，不仅操作时间长，而且检出敏感性差，不利于 对食品质量把关。所W发明一种耗时短，易推广的检测方法对其进行检测、监控，对保障食 品生产、加工及物流过程中的质量安全具有积极的作用。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供一种可同时检测四种大肠埃希氏菌的检测试剂盒及 检测方法，具有检测时间短、灵敏度高的特点。本发明通过W下技术方案实现：四种大肠埃 希氏菌的检测试剂盒，该试剂盒包括W下组分：
[0004] (1)肠道致病性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一CTGAACGGCGATTACGCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，浓度为 0. 3-0. 5ymol/L;
[000引 似肠产毒素性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，浓度为 0. 5-0. 7ymol/L; [000引 做肠道侵袭性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -CTGGATGGTATGGTGAGG- 3,，下游引物 5' 一GGAGGCCAACAATTATTTCC- 3'，浓度为 0. 7-0. 9ymol/L;
[0007] (4)肠道出血性大肠埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5' 一CTTTTCTAACTC TGGTGTCGG-3'，下游引物 5'一TTGGTAGGGGTTGTATGC-3'，浓度为 0.1-0.Symol/L；
[000引 巧)TaqDNA聚合酶浓度为：1-2U/yL;
[0009](6) IOX聚合酶链式反应缓冲液：8-12vt% ;
[0010] (7)]\%(：12浓度为：1-3111111〇1/1;
[0011] (8)脱氧核糖核巧S憐酸浓度为：0. 1-0. 3mmol/L。
[0012] 优选的，该试剂盒包括W下组分：
[001引 （1)肠道致病性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一CTGAACGGCGATTACGCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，浓度为 0. 4ymol/L;
[0014] 似肠产毒素性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，浓度为 0. 6ymol/L;
[001引 做肠道侵袭性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5 ' 一CTGGATGGTATGGTGAGG- 3,，下游引物5,一GGA GGC CAA CAA TTA TTT CC-3,，浓度为0. 8 ymol/L ;
[001引（4)肠道出血性大肠埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5' -CTT TTC TAA CTC TGG TGT CGG_3'，下游引物 5' _TTG GTA GGG GTT GTA TGC_3'，浓度为 0. 2ymol/L ;
[0017]巧)TaqDNA聚合酶浓度为：1. 5U/yL;
[0018] (6) 10X聚合酶链式反应缓冲液：IOvt%;
[0019] (7)]\%(：12浓度为：2111111〇1/1;
[0020] (8)脱氧核糖核巧S憐酸浓度为：0.2mmol/L。
[0021] 本发明同时请求保护所述四种大肠埃希氏菌的检测试剂盒的检测方法，该方法包 括W下顺序的步骤：
[0022] (一）制备阳性对照
[0023] (1)将肠道致病性大肠埃希氏菌、肠产毒素性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希 氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌〇157:H7进行活化培养，分别得到四种菌的培养液；
[0024] 似分别取步骤（1)所得四种菌的培养液与LysisBuffer细胞裂解液混合均匀 后，置于80°C的水浴中，裂解30min，取出后离屯、4min，取上清液作为聚合酶链式反应模板；
[0025] (3)分别取步骤（2)所得聚合酶链式反应模板，添加到试剂盒中，在聚合酶链式反 应扩增仪上解育，其参数为95°C预热变性3min，94°C变性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA 延伸40s，30个循环，72°C延伸IOmin再冷却至4°C，结束聚合酶链式反应扩增，分别得到四 种菌的扩增产物；
[0026] (4)分别取步骤（3)得到四种菌的扩增产物与6XLoadingbuffer缓冲液混匀，在 95V恒压下于3wt%的琼脂糖凝胶中，电泳50min;在GelRed染料稀释液里染色20min，所述 GelRed染料稀释液为：15微升GelRed和5mLIM化Cl混匀后加到45ml蒸馈水中，可分别 得到四种菌的条带，作为阳性对照.
[0027](二）检测样品
[002引（1)将待测样品放入装有蛋白腺水的无菌均质袋中，在均质器上拍打均匀，得到样 液；
[002引似取样液加入到Lysis Buffer细胞裂解液中，80°C水浴裂解20min后，离屯、 lOmin，取上清液作为聚合酶链式反应模板；
[0030] (3)取步骤（2)所得聚合酶链式反应模板，添加到试剂盒中，在聚合酶链式反应扩 增仪上解育，其参数为95°C预热变性3min，94°C变性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA延伸 40s，30个循环，72°C延伸IOmin再冷却至4°C，结束聚合酶链式反应扩增，得到样品扩增产 物；
[00引](4)取步骤（3)得到的样品扩增产物与6XLoadingbuffer缓冲液混匀，在95V恒 压下于3wt%的琼脂糖凝胶中，电泳50min;在GelRed染料稀释液里染色20min，将所得条 带分别与阳性对照。
[0032] 优选的，所述的活化培养为：将肠道致病性大肠埃希氏菌、肠产毒素性大肠埃希氏 菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌〇157:H7分别接种于LB液体培养 基中，置于37°C，培养24h。
[0033] 本发明的有益效果如下：
[0034] (1)本发明提供的试剂盒和检测方法可同时检出食品中的4种大肠埃希氏菌，检 测灵敏度高；
[003引似本发明提供的试剂盒和检测方法可在3-6小时内完成检测，耗时短，检测速度 快；
[003引做本发明提供的试剂盒和检测方法相比测序、杂交及忍片等传统检测技术，本发 明方法的检测程序简单、易推广，可W推广至食品生产企业及相关检测机构使用。
【附图说明】
[0037]图1为本发明检测结果电泳图；
[003引其中：l、1000bp DNA marker, 2、待检测样品，3、肠道致病性大肠埃希氏菌，4、产肠 毒素大肠埃希氏菌，5、肠道侵袭性大肠埃希氏菌，6、肠道出血性大肠埃希氏菌0157 :H7,7、 阴性对照。
【具体实施方式】
[0039]W下通过实施例对本发明做进一步说明：
[0040] 如无特殊说明，本发明所用原料均市售可得，作为优选，本实施例中所用试剂均购 自宝生物工程（大连）有限公司；聚合酶链式反应扩增仪：Thermo Scientific Arkt化系列 多功能PCR仪购自美国赛默飞科技有限公司；肠致病性大肠埃希氏菌CICC 10663、肠产毒 性大肠埃希氏菌CICC 10665、肠侵袭性大肠埃希氏菌CICC 10661、大肠杆菌0157 :H7 CICC 21530均购自中国工业微生物菌种保藏中屯、；本实施例试剂盒的反应体系为25 y L ;
[0041] 实施例通过W下方法制备阳性对照：
[0042] (1)将肠道致病性大肠埃希氏菌、肠产毒素性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃 希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌0157:H7分别接种于LB液体培养基中，置于37°C，培养 24h，分别得到四种菌的培养液；
[004引 似分别取步骤（1)所得四种菌的培养液培养液1000化与80yLLysisBuffer 细胞裂解液混合均匀后，置于80°C的水浴中，裂解30min，取出后离屯、4min，取上清液作为 聚合酶链式反应模板；
[0044] (3)分别取步骤（2)所得聚合酶链式反应模板1 ^以添加到试剂盒中，在聚合酶 链式反应扩增仪上解育，其参数为95°C预热变性3min，94°C变性30s，60°C引物退火30s， 72°CDNA延伸40