s，30个循环，72°C延伸IOmin再冷却至4°C，结束聚合酶链式反应扩增，分 别得到四种菌的扩增产物.
[004引 （4)分别取步骤做得到四种菌的扩增产物5yL与1yLeXLoadingbuffer缓 冲液混匀，在95V恒压下于3wt%的琼脂糖凝胶中，电泳50min;在GelRed染料稀释液里染 色20min，可分别得到四种菌的条带，作为阳性对照：183bp和917bp的条带，则判定为肠道 出血性大肠埃希氏菌0157:H7 ;320bp的条带，则判定为肠道侵袭性大肠埃希氏菌；500bp 的条带，则判定为产肠毒素大肠埃希氏菌；917bp的条带，则判定为肠道致病性大肠埃希氏 困。
[0046] 实施例1
[0047] 检测试剂盒包括W下组分：
[004引 （1)肠道致病性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5'一CTG AAC GGC GAT TAC GCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，浓度为 0. 3ymol/L;
[0049] 似肠产毒素性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，浓度为 0. 5ymol/L;
[0050] 做肠道侵袭性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -CTGGATGGTATGGTGAGG-3,，下游引物 5, 一GGAGGCCAACAATTATTTCC- 3,，浓度为 0. 9ymol/L;
[005。 （4)肠道出血性大肠埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5' -CTTTTCTAACTC TGGTGTCGG_ 3'，下游引物 5' _TTGGTAGGGGTTGTATGC_ 3'，浓度为 0. 3ymol/L;[005引巧)TaqDNA聚合酶浓度为：IU/yL;
[00閲（6)IOX聚合酶链式反应缓冲液：12vt% ;
[0054] (7)]\%(：12浓度为：3111111〇1/1;
[00财 做脱氧核糖核巧S憐酸浓度为：0.Immol/L;
[005引样品检测：
[0057] (1)无菌操作取苹果样品lOg，分别按照IO9C化/血人工污染四种致病菌，在无菌 操作台中吹干Ih后，放入含有90血0.Iwt%蛋白腺水的无菌均质袋中，在均质器上拍打混 匀，取1. 0血样液分别加50yLLysisBuffer细胞裂解液，80°C水浴裂解20min，lOOOr/min 离屯、lOmin，取上清液作为聚合酶链式反应模板；
[0058] (2)将步骤（1)所得聚合酶链式反应模板添加到检测试剂盒中，在聚合酶链式反 应扩增仪上解育，其参数为95°C预热变性3min，94°C变性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA 延伸40s，30个循环，72°C延伸IOmin再冷却至4°C，结束聚合酶链式反应扩增，得到样品扩 增产物.
[005引做将步骤似所得样品扩增产物5化与IyiexLoadingbuffer缓冲液混匀， 在95V恒压下于3wt%的琼脂糖凝胶中，电泳50min。在GelRed染料稀释液里染色20min， 在凝胶成像系统下观察，与阳性对照对比。
[0060] 实施例2
[0061] 检测试剂盒包括W下组分：
[006引（1)肠道致病性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -CTGAACGGCGATTACGCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，浓度为 0. 5ymol/L;
[006引 似肠产毒素性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，浓度为 0. 7ymol/L;
[0064] 做肠道侵袭性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -CTGGATGGTATGGTGAGG- 3,，下游引物 5, 一GGAGGCCAACAATTATTTCC- 3,，浓度为 0. 7ymol/L;
[006引（4)肠道出血性大肠埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5'-CTTTTCTAACTC TGGTGTCGG_ 3'，下游引物 5' _TTGGTAGGGGTTGTATGC_ 3'，浓度为 0. 1ymol/L;
[0066] 巧)TaqDNA聚合酶浓度为：2U/yL;
[0067] (6) IOX聚合酶链式反应缓冲液：8vt%;
[0068] (7)]\%(：12浓度为：1111111〇1/1;
[0069] (8)脱氧核糖核巧S憐酸浓度为：0. 3mmol/L ;
[0070] 样品检测：
[0071] (1)无菌操作取木瓜样品lOg，分别按照IO9C化/血人工污染四种致病菌，在无菌 操作台中吹干Ih后，放入含有90血0.Iwt%蛋白腺水的无菌均质袋中，在均质器上拍打混 匀，取1. 0血样液分别加50yLLysisBuffer细胞裂解液，80°C水浴裂解20min，lOOOr/min 离屯、lOmin，取上清液作为聚合酶链式反应模板；
[0072] (2)将步骤（1)所得聚合酶链式反应模板添加到检测试剂盒中，在聚合酶链式反 应扩增仪上解育，其参数为95°C预热变性3min，94°C变性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA延伸40s，30个循环，72°C延伸IOmin再冷却至4°C，结束聚合酶链式反应扩增，得到样品扩 增产物.
[007引做将步骤似所得样品扩增产物5化与IyiexLoadingbuffer缓冲液混匀， 在95V恒压下于3wt%的琼脂糖凝胶中，电泳50min。在GelRed染料稀释液里染色20min， 在凝胶成像系统下观察，与阳性对照对比。
[0074] 实施例3
[0075] 检测试剂盒包括W下组分：
[007引（1)肠道致病性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一CTGAACGGCGATTACGCG AA- 3'，下游引物 5' 一CCAGACGATACGATCCAG- 3'，浓度为 0. 4ymol/L;
[0077] 似肠产毒素性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一GGCGACAGATTATACCGT GC- 3，，下游引物 5, 一CGGTCTCTATATTCCCTGTT- 3，，浓度为 0. 6ymol/L;
[007引做肠道侵袭性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' -CTGGATGGTATGGTGAGG- 3,，下游引物 5, 一GGAGGCCAACAATTATTTCC- 3,，浓度为 0. 8ymol/L;
[007引（4)肠道出血性大肠埃希氏菌0157:H7的引物：上游引物5' -CTTTTCTAACTC TGGTGTCGG- 3'，下游引物 5' 一TTGGTAGGGGTTGTATGC- 3'，浓度为 0. 2ymol/L;
[0080] (5)hqDNA聚合酶浓度为：1. 5U/yL;
[0081] (6) 10X聚合酶链式反应缓冲液：IOvt%;
[008引（7)MgClz浓度为：2mm0l/L ;
[0083] (8)脱氧核糖核巧S憐酸浓度为：0. 2mmol/L ;
[0084] 样品检测：
[0085] (1)无菌操作取渡菜样品lOg，分别按照IO9C化/ml人工污染四种致病菌，在无菌 操作台中吹干Ih后，放入含有90血0.Iwt%蛋白腺水的无菌均质袋中，在均质器上拍打混 匀，取1. 0血样液分别加50yLLysisBuffer细胞裂解液，80°C水浴裂解20min，lOOOr/min 离屯、lOmin，取上清液作为聚合酶链式反应模板；
[0086] (2)将步骤（1)所得聚合酶链式反应模板添加到检测试剂盒中，在聚合酶链式反 应扩增仪上解育，其参数为95°C预热变性3min，94°C变性30s，60°C引物退火30s，72°CDNA 延伸40s，30个循环，72°C延伸IOmin再冷却至4°C，结束聚合酶链式反应扩增，得到样品扩 增产物.
[0087] 做将步骤似所得样品扩增产物5化与IyiexLoadingbuffer缓冲液混匀， 在95V恒压下于3wt%的琼脂糖凝胶中，电泳50min。在GelRed染料稀释液里染色20min， 在凝胶成像系统下观察，与阳性对照对比。
[008引实施例4
[0089] 检测试剂盒包括W下组分：
[0090] (1)肠道致病性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' 一CTGAACGGCGATTACGCG AA - 3'，下游引物5'一CCA GAC GAT ACG ATC CAG-3'，浓度为 0.3 ymol/L ;
[00川似肠产毒素性大肠埃希氏菌的引物：上游引物5' - GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC - 3，，下游引物5,一CGG TCT CTA TAT TCC CTG TT - 3，，浓度为 0. 6ymol/L ;
[009引做肠道侵袭