用于使用耐热的错配内切核酸酶的方法

用于使用耐热的错配内切核酸酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及识别和切割双链核酸中的错配碱基对的耐热的错配内切核酸酶，包含 所述错配内切核酸酶的组合物，和使用所述错配内切核酸酶的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，已经显著开发了生物技术。具体地，在伴随基因组分析技术的进步的大规 模基因组分析的结果中，已经积累了大量基因组序列信息。此外，基于上述信息与各种生理 功能的分析的组合，已经发现了许多功能性基因突变。运些突变的分析已经用于人类的基 因诊断，W及农作物的改良和有用微生物的分离或生成，因此已经大大促进一般生活。
[0003] 通过基因组序列的直接分析或通过使用识别错配的碱基对的酶进行突变分析。突 变分析方法包括用能够特异性结合至由突变型DNA和野生型DNA形成的错配碱基对的因子 进行检测。突变分析方法的代表性实例包括通过使用来自大肠杆菌的MutS、MutT和MutL 复合物检测突变位点（专利文献1)。
[0004] 包括使用特异性切割错配位点的错配内切核酸酶的突变分析方法也是已知的。在 该方法中，错配内切核酸酶用于切割错配碱基对附近的DNA，且分析因此获得的DNA片段W 检测突变的存在或不存在和位置。作为代表性实例，包括使用来自芹菜的Cell基因产物的 方法是已知的（专利文献2)，且该方法实际用于碱基突变的分析。然而，该酶是不耐热的， 因此无法用于设及高溫反应过程诸如PCR的技术中。因此，为了检测碱基突变，该方法需要 扩增、形成错配、切割错配和检测的四个步骤。
[0005] 除了突变分析W外，具有大量影响力的生物技术的实例还包括核酸扩增技术。
[0006] 核酸扩增技术的代表性实例是聚合酶链式反应（PCR)。PCR是用于容易地体外扩 增核酸的期望片段的技术。PCR是在广泛领域包括生物学、医学和农业W及关于基因的研究 的领域中是必要的实验技术。PCR也被应用于检测突变基因和分析DNA的甲基化。
[0007] 等溫核酸扩增方法，诸如LAMP方法和ICAN方法，不需要特殊设备，因此，它们被用 作检测核酸的更便宜的方法。
[0008] 对于近年来已经进行的全基因组的结构分析，全基因组扩增方法是重要的技术， 特别是用于分析稀有样品。
[0009] 在运些核酸扩增方法中，不正确碱基的渗入W恒定概率发生。该概率已经通过改 进聚合酶等而降低。然而，不正确碱基的渗入仍然干扰精确的分析。
[0010] 核酸扩增技术不仅用于扩增具有特定核巧酸序列的DNA，而且用于扩增在两端具 有共同核巧酸序列区域的DNA的混合物。此类核酸扩增技术的具体实例包括基因组文库或 cDNA文库的构建。然而，在构建此类文库中，优先扩增具有更高含量的DNA分子，其可W干 扰各种类型的DNA的分析或筛选。
[0011] 为了解决上述问题，具有较高含量的DNA的比例通过利用自我杂交的标准化而降 低（非专利文献1)。还使用组合PCR和自我杂交的SSH-PCR(非专利文献2)。然而，使用 运些方法，还可W去除与具有较高含量的DNA同源的DNA。
[0012] 在通过核酸扩增方法检测DM中，目标DM和非目标DM可w竞争扩增。换言之， 当与扩增目标DNA的同时扩增非目标DNA时，难W检测目标DNA。上述问题可W通过使用实 时PCR来解决，在所述实时PCR中，探针诸如循环探针或化qMan探针用于仅检测目标DNA。 然而，在其中非目标DNAW相对于目标DNA过度大量存在的情况下，因为具有许多类似DNA 的假阳性反应，难W检测目标DNA。
[0013] 此类问题可W在W下中发生：在正常等位基因存在的情况下检测少量突变等位基 因（例如，检测循环肿瘤基因），通过表观遗传测定检测少量甲基化或非甲基化的等位基 因，检测在母体血液中循环的少量胎儿DNA序列等。
[0014] 为了解决上述问题，已经开发了被称为限制性内切核酸酶介导的选择性聚合酶链 式反应的方法（PCRREM巧（非专利文献3)。此方法设及使用耐热的限制性酶。在该方法 中，使用引物选择性检测具有突变核巧酸序列的DNA，设计所述引物，例如，使得仅当模板具 有正常的核巧酸序列时限制性酶的切割才发生。然而，根据待检测的目标DNA，不存在具有 适合于通过REMSPCR检测的识别序列的耐热限制性酶。
[001引 引用列表 专利文献 专利文献1:US5922539B专利文献 2 :W0 01/062974 非专利文献 非专利文献 1:"NucleicAcidsResearch", 2004February,vol. 32,No. 3,e37 非专利文献 2:"MethodsinMolecularBiology", 2009,vol. 496,No. 2,pp. 223-243 非专矛U文南犬 3:"AmericanSocietyforInvestigativePathology", 1998August,vol. 153,No. 2,pp. 373-379。
[001引发明概述 技术问题 本发明的目的包括提供耐热的错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物， 和使用所述错配内切核酸酶的方法。
[0017] 问题的解决方案 作为在上述情况下的大量努力的结果，本发明人已经发现，已被认为是复制机制中的 因子的来自古细菌的蛋白具有耐热的错配内切核酸酶活性。
[0018] 本发明人还已经发现，在错配内切核酸酶和被设计W便当寡脱氧核巧酸与具有特 定核巧酸序列的核酸杂交时生成一个或多个错配的寡脱氧核巧酸存在的情况下的核酸扩 增反应中，具有特定核巧酸序列的DNA的扩增受到抑制。
[0019] 此外，本发明人已经成功地生成具有增加特异性的耐热的错配内切核酸酶的突变 体。已经发现，当使用突变错配内切核酸酶时，除了特定错配碱基对W外的碱基对的切割受 到抑制，允许扩增的更特异性抑制。因此，已经完成了本发明。
[0020] 具体地，本发明的第一个方面提供：
[1]切割双链核酸的方法，所述方法包括： 用至少一种选自W下（i)至（iii)的多肤处理具有错配的碱基对的双链核酸，W便在 所述错配的碱基的位置处切割所述双链核酸的两条链，a)具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肤； (ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基而不同于SEQIDNO: 1 的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肤；和 (iii) 具有与SEQIDN0:1的氨基酸序列共享至少50%氨基酸序列同一性的氨基酸序 列且具有错配内切核酸酶活性的多肤；
[2]根据[1]的方法，其中所述错配的碱基对包含通常在所述双链核酸上配对的两个 碱基对之间存在的连续的1至8个错配的碱基对； 閒组合物，其包含W下（a)至（C): (a)DNA聚合酶； 化）至少一对寡核巧酸引物；和 (C)至少一种选自W下（i)至（iii)的多肤： a)具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的多肤； (ii) 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基而不同于SEQIDNO: 1 的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肤；和 (iii) 具有与SEQIDNO: 1的氨基酸序列共享至少50%氨基酸序列同一性的氨基酸序 列且具有错配内切核酸酶活性的多肤；
[4]扩增核酸的方法，所述方法包括W下步骤（a)和化）： (а) 制备包含根据权利要求3的组合物和作为模板的核酸分子的组合物；和 化）使通过步骤（a)获得的组合物在合适的条件下反应W进行核酸扩增；
[引根据[4]的方法，其中通过聚合酶链式反应（PCR)方法、等溫核酸扩增方法或多重 置换扩增（MDA)方法进行所述核酸扩增；
[б] 多肤，其选自W下（A)至似： (A)具有通过用另一种氨基酸残基取代位置77的色氨酸而不同于SEQIDNO: 1的氨基 酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肤； 做具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的氨基酸W外的1至10个氨基 酸残基而不同于（A)的多肤的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多 肤讯 (C)具有与SEQIDNO: 1的氨基酸序列共享至少50%氨基酸序列同一性的氨基酸序列 且具有错配内切核酸酶活性的多肤，其中对应于SEQIDN0:1的氨基酸序列中的位置77的 色氨酸的氨基酸残基用另一种氨基酸残基取代；
[7]根据[6]的多肤，其选自W下（A)至似： (A)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肤； 度）具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的苯丙氨酸W外的1至10个氨 基酸残基而不同于SEQIDN0:2的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的 多肤讯 (C)具有与SEQIDNO: 1的氨基酸序列共享至少50%氨基酸序列同一性的氨基酸序列 且具有错配内切核酸酶活性的多肤，其中对应于SEQIDN0:1的氨基酸序列中的位置77的 色氨酸的氨基酸残基用苯丙氨酸取代；
[引抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核巧酸序列的核酸的方法，所述方法包括在W下（a)至（d)存在的情况下进行核酸扩增反应的步骤： (a)寡脱氧核巧酸，所述寡脱氧核巧酸被设计W便当所述寡脱氧核巧酸与具有特定核 巧酸序列的核酸或其互补链杂交时生成一个至几个错配； 化)DNA聚合酶； (C)至少一对寡核巧酸引物；和 (d)具有错配内切核酸酶活性的多肤；
[9] 根据[引的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应（PCR)方法或等溫核酸 扩增方法；
[10]根据巧]的方法，其中所述具有错配内切核酸酶活性的多肤是至少一种选自W下 (i)至（Vi)的多肤： a)具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的多肤；
[11] 具有通过取代、缺失、插入和/或添加1至10个氨基酸残基而不同于SEQIDNO: 1 的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的多肤； (iii) 具有与SEQIDNO: 1的氨基酸序列共享至少50%氨基酸序列同一性的氨基酸序 列且具有错配内切核酸酶活性的多肤； (iv) 具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肤； (V)具有通过取代、缺失、插入和/或添加除了位置77的苯丙氨酸W外的1至10个氨 基酸残基而不同于SEQIDN0:2的氨基酸序列的氨基酸序列且具有错配内切核酸酶活性的 多肤讯 (Vi)具有与SEQIDNO: 1的氨基酸序列共享至少50%氨基酸序列同一性的氨基酸序 列且具有错配内切核酸酶活性的多肤，其中对应于SEQIDN0:1的氨基酸序列中的位置77 的色氨酸的氨基酸残基用苯丙氨酸取代；
[11] 优先扩增目标DNA的方法，所述方法包括通过根据[引的方法抑制具有在一个至 几个核巧酸中与目标DNA的核巧酸序列不同的核巧酸序列的DNA的扩增：
[12] 根据[11]的方法，其用于扩增具有野生型核巧酸序列的DNA或含有单核巧酸多 态性突变的DNA，其中野生型DNA的扩增和含有单核巧酸多态性突变的DNA的扩增彼此区 分；
[13] 根据[12]的方法，其中所述单核巧酸多态性突变与癌变或用于治疗癌症的药剂 的治疗效果相关联；
[14] 根据山]的方法，其中通过聚合酶链式反应（PCR)方法或等溫核酸扩增方法进 行所述DNA扩增反应。
[00川发明效果 根据本发明，提供了在生物技术中具有巨大实用性的耐热的错配内切核酸酶，包含所 述错配内切核酸酶的组合物，和使用所述错配内切核酸酶的方法。
[0022] 附图简述 图1显示实施例2中的聚丙締酷胺凝胶电泳的结果。
[002引图2显示基于实施例2中的巧光强度的增加的蛋白PF0012的错配切割活性。[0024]图3显示基于实施例3中的巧光强度的增加的PF0012同源蛋白的错配切割活性。
[002引图4显示基于实施例5中的巧光强度的增加的突变PF0012同源蛋白的错配切割 活性。
[0026] 图5显示实施例6中通过实时PCR技术对具有特定核巧酸序列的DNA的扩增的抑 制。
[0027] 图6显示通过HRM分析方法对单一核巧酸突变的基因的检测。
[0028] 实施方案的描述 在本发明中，词语"错配"是指双链核酸中存在的不同于Watson-化ick碱基对的碱基 配对，换言之，除了G(鸟嚷岭碱基）-C(胞喀晚碱基）和A(腺嚷岭碱基）-T(胸腺 喀晚碱基）或U(尿喀晚碱基）的碱基配对W外的组合的碱基的结合。
[0029] 如本文所使用，具有错配内切核酸酶活性的多肤（有时称为错配内切核酸酶）是 指具有切割双链核酸中存在的错配位点的活性的核酸