可W进一步含 有选自反应缓冲剂、二价金属离子、脱氧核糖核巧酸、寡核巧酸探针和嵌入染料中的至少一 者。上述组合物可W进一步含有作为用于核酸扩增反应的模板的核酸。
[0047] 可W通过任何核酸扩增方法进行本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定 核巧酸序列的核酸的方法。优选使用扩增DNA的方法，但本发明不限于此。可W进行本发 明，例如，通过PCR方法、MDA方法或等溫核酸扩增方法，诸如LAMP方法或ICAN方法。
[0048] 可W将本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核巧酸序列的核酸的方法 应用于扩增任何核酸。当DNA用作待扩增的目标时，DNA的实例包括人工制备的DNA混合 物、来自环境的样品、生物体样品或从上述样品制备的DNA混合物中存在的DNA。生物体样 品的实例包括，但不限于，来自哺乳动物诸如人的样品。DNA混合物的实例包括，但不限于， 基因组DNA片段的混合物，通过逆转录反应从mRNA生成的cDNA的混合物，和多种PCR产物 的混合物。经受扩增的抑制的具有特定核巧酸序列的DNA的实例包括不经分离且保持的来 自rRNA的逆转录产物，和通过引物之间的配对生成的低分子量DNA。当扩增基因文库和随 后功能筛选之后，可W通过抑制表现出阳性信号的具有已知基因的序列的DNA的扩增来制 备能够有效地捜索未知基因的文库。
[0049] 适当地可W通过检查每种反应系统中的不抑制DNA扩增反应的浓度或有效切割 错配的碱基对的浓度，来测定本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核巧酸序列的 核酸的方法巧]的（d)中的具有错配内切核酸酶活性的多肤的浓度。（a)中的寡脱氧核巧 酸的浓度可W通过优化使用浓度、同时考虑模板的量或目标DNA的扩增效率来测定。例如， 寡脱氧核巧酸的浓度可W是用于扩增反应的引物的浓度的0.1至10倍。
[0050] 优先扩增本发明的目标DNA的方法[11]可W进一步包括检测扩增的目标DNA的 步骤。如本文所使用，本发明的该方面，有时被称为"本发明的检测方法"。例如，根据本发 明的检测方法（其中，当不是待检测的目标的DNA(具有特定核巧酸序列的DNA)W相对于 作为待检测的目标的DNA(目标DNA)W过度大量存在时，DNA被用作待检测的目标），作为 模板的非目标DNA的扩增，凭借本发明的抑制在核酸扩增反应中扩增具有特定核巧酸序列 的核酸的方法[引的（a)中的寡脱氧核巧酸和（d)中的具有错配内切核酸酶活性的多肤而 抑制，因此可W检测待检测的目标DNA。
[0051] 本发明的检测方法能够区别地检测例如对应于其中已知存在基因中的突变的基 因的核酸的野生型和突变型。当使用具有野生型核巧酸序列的DNA作为具有特定核巧酸序 列的核酸进行本发明的检测方法时，可W在过度大量的正常等位基因（即，具有野生型核 巧酸序列的DNA)存在的情况下检测少量突变等位基因。例如，本发明的方法可用于检测循 环肿瘤DNA，或检测母体血液中含有的少量胎儿DNA序列。突变的实例包括微缺失和点突 变。由点突变生成的多态性被称为单核巧酸多态性（SNP)。如本文所使用，在SNP间具有突 变核巧酸多态性的DNA有时被称为具有单核巧酸多态性突变的DNA。
[0052] 具有特定核巧酸序列的核酸可W优选是含有至少一个选自用作肿瘤标志物的单 核巧酸多态性、与用于治疗癌症的药剂的治疗效果相关的单核巧酸多态性和已知与细胞的 癌变相关的单核巧酸多态性的单核巧酸多态性的核酸，但是本发明不具体限于此。SNP的 实例包括肿瘤细胞中经常发现的那些，和已知与用于治疗癌症或癌症发生的药剂的治疗效 果相关的那些。此类SNP的实例包括K-ras基因、B-raf基因和表皮生长因子受体巧GFR) 基因的SNP。K-ras基因中的体细胞突变经常发现于结肠直肠癌、肺腺癌、甲状腺癌等中。 B-raf基因中的体细胞突变经常发现于结肠直肠癌、恶性黑色素瘤、乳头状甲状腺癌、非小 细胞肺癌、肺腺癌等中。EGFR基因中的体细胞突变经常发现于各种实体瘤中。已知的是，当 癌组织中的EGFR基因具有特异性单核巧酸多态性突变时，用EGFR抑制剂诸如吉非替尼或 埃罗替尼治疗癌症可能是有效的。相反，已知的是，当癌组织中的K-ras基因具有单核巧酸 多态性突变时，癌症可能对EGFR抑制剂是耐受的。
[0053] 可W使用用亚硫酸氨盐处理从生物体样品提取的含有甲基化DNA的组合物之后 获得的DNA作为材料，进行本发明的检测方法。根据本发明的检测方法，可W进行在过度大 量的非甲基化等位基因存在的情况下检测少量甲基化等位基因，或在过度大量的甲基化等 位基因存在的情况下检测少量非甲基化等位基因。
[0054] 作为用亚硫酸氨盐处理，可W使用用于检测甲基化DNA的已知亚硫酸氨盐方法。 通过处理，非甲基化胞喀晚变为尿喀晚，而甲基化胞喀晚不改变。当用亚硫酸氨盐处理的反 应混合物通过PCR进行扩增时，尿喀晚变为胸腺喀晚且甲基化胞喀晚变为胞喀晚。换言之， 在特定位点存在过度大量的非甲基化等位基因的情况下检测少量甲基化等位基因，和在过 度大量的甲基化等位基因存在的情况下检测少量非甲基化等位基因分别对应于在过度大 量的胸腺喀晚存在的情况下检查胞喀晚的存在，和在过度大量的胞喀晚存在的情况下检查 胸腺喀晚的存在。当过度大量的含有胸腺喀晚或胞喀晚的DNA的扩增被抑制时，容易地检 查少量的甲基化等位基因或非甲基化等位基因的存在。
[0055] 对于本发明的检测方法中检测目标核酸的步骤，可W使用电泳、核巧酸序列分析 或使用探针（如循环探针或化qMan探针）的实时PCR。对于运些检测方法，可W直接使用 常规技术。具体而言，高分辨率烙解（HRM)分析方法的使用允许通过一个步骤扩增和检测 目标DNA，且因此达到目标DNA的快速和简单的检查。 实施例
[0056] 本发明将借助实施例更具体地解释，本发明不限于所述实施例。
[0057] 制备例1 :基因组DNA的制备 遵循日本专利号3742659的实施例1中描述的方法制备激烈热球菌的基因组DNA。遵 循W002/22831的实施例8中描述的方法制备化ermococ州Sbarophilus和詹氏甲烧球 菌的基因组DNA，除了使用Thermococ州Sbarophilus和詹氏甲烧球菌替代海滨热球菌 (Thermococ州Slitoralis)作为微生物菌株。运些微生物菌株可得自德国微生物菌种保藏 中屯、（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)。
[005引制备例2 :蛋白PF0012的制备 (1)pET-PF12(用于表达PF0012的质粒）的制备 对于蛋白PF0012的功能性分析，构建用于在大肠杆菌（大肠杆菌）中的强制表达的 系统。对于使用In-Fusion(注册商标）皿克隆试剂盒（由TAKARABI0INC.制造）从 GenbankAcc.NC_003413中显示的激烈热球菌克隆PF0012的蛋白编码区域（核巧酸编号 11810-12610)，设计两个引物PF12F和PF12R。PF0012的氨基酸序列显示于沈QIDNO: 1。 引物PF12F和PF12R的核巧酸序列分别显示于SEQIDN0:3和SEQIDN0:4。作为模板 的来自激烈热球菌的基因组DM、运些引物和PrimeSTAR(注册商标）服DNA聚合酶（由 TAKARABI0INC.制造）用于扩增所述区域。扩增区域的核巧酸序列显示于SEQIDNO:5。 使用In-Fusion(注册商标）皿克隆试剂盒将扩增的片段插入质粒祀T巧b(由Merck MilliporeCo巧oration制造）中的Ndel和BamHI切割位点之间。In-Fusion反应混合物 用于转化大肠杆菌JM109。从表现出氨节青霉素抗性的克隆分离用于表达PF0012的质粒 PET-PF12。从保留该质粒的大肠杆菌的粗提取物，通过实施例2中描述的方法检测错配内 切核酸酶活性。然而，该质粒非常不稳定，且频繁引起内部缺失。因此，所述质粒不适于产 生蛋白。
[0059] 似祀T-OP巧F12 (用于表达PF0012的优化质粒）的制备 由于使用祀T-PF12表达蛋白PF0012不稳定，所W设计核巧酸序列W通过大肠杆菌类 型密码子编码PF0012的氨基酸序列，且人工合成含有所述核巧酸序列的DNA。该DNA的核 巧酸序列显示于SEQIDN0:6。用限制酶Ndel和BamHI消化该DNA，然后纯化。使用DNA 连接试剂盒<Mi曲tyMix〉（由TAKARABI0INC.制造）将因此获得的DNA片段插入Ndel 和BamHI限制性位点之间。连接反应混合物用于转化大肠杆菌JM109。选择表现出氨节青 霉素抗性的克隆。从所述克隆获得用于表达PF0012的优化质粒祀T-OP巧F12。
[0060] (3)蛋白PF0012的表达 用质粒祀T-OP巧F12转化大肠杆菌化21DE3。分离表现出氨节青霉素抗性的克隆。将 因此获得的新鲜单一菌落在2ml含有100yg/ml氨节青霉素的LB培养基下，称为 LB-AP培养基）中在37°C培养过夜。向50mlLB-AP培养基添加500y1过夜培养物，且然 后在37°C培养3小时。然后，向培养溶液，WImM的最终浓度添加IPTG，然后在37°C培养 3小时。培养完成之后，将培养溶液W6000Xg离屯、10分钟，W便从培养溶液收获细菌细 胞。
[0061] (4)蛋白PF0012的纯化 将上述细菌细胞悬浮于3ml含有50mM化is-HCl，pH7. 5和100ml化C1的溶液（W下，称为缓冲液A)中，且进行使用VP-5S叫tras.均化器（由TA口EC制造）的超声波破碎。 持续30秒钟的超声波处理重复3次之后，悬浮液变得透明。
[0062] 将超声波处理之后的悬浮液在95°C加热10分钟W变性热不稳定蛋白，然后W 17000 Xg离屯、10分钟。收集上清液。向因此获得的粗提取物，添加500 iil Ni-NTA琼脂 糖（由QIAGEN制造），随后在4°C轻轻揽拌2小时。将树脂填充至Econo-Pac(注册商标） 柱（由Bio-Rad L油oratories, Inc.制造），且用20 ml含有5mM咪挫的缓冲液A洗涂。 洗涂之后，1ml含有300mM咪挫的缓冲液用于洗脱蛋白PF0012。将洗脱物用缓冲液A在4°C 透析两次，然后用含有50%甘油的缓冲液A在4°C透析过夜，W获得含有蛋白PF0012的溶 液。
[0063] 制备例3 :PF0012同源蛋白的制备 (1) pET-TBA和pET-MJA(用于表达PF0012同源蛋白的质粒）的制备 为了从属于古细菌的两种菌株（Thermococcusbarophilus和詹氏甲烧球菌）分离 PF0012同源蛋白的目的，克隆编码所述蛋白的区域。来自运两种菌株的PF0012同源蛋白的 氨基酸序列分别显示于沈QIDN0:7和沈QIDN0:8。
[0064] 从Genbank Acc. CPO〇2372. 1和Genbank Acc. NC_00〇9〇9. 1中显示的核 巧酸序列信息，获得对应于PF0012同源蛋白的序列信息灯ERMP_01877:核巧酸编号 1674836-1675591和MJ_0225:核巧酸编号215449-216240)。设计和制备用于克隆对应 基因的引物。对于TERMP_01877基因的克隆，使用引物TBA1877F和TBA1877R的对。对于 MJ_0225基因的克隆，使用引物MJ255F和MJ255R的对。运些引物的核巧酸序列分别显示于 沈Q ID N0:9、10、ll和12。
[0065] 作为模板的来自Thermococ州Sbarophilus或詹氏甲烧球菌的基因组DNA、上述 引物对和PrimeSTAR(注册商标）服DM聚合酶（由TAKARABIOINC.制造）用于扩增 所述区域。扩增的〇臟的核巧酸序列显示于56〇10^:13和14。^与制备上述祀了斗尸12 相同的方式，将扩增的DNA各自插入质粒祀T巧b，W获得质粒祀T-TBA和质粒祀T-MJA。
[0066] 似PF0012同源蛋白的表达 W与上述蛋白PF0012的表达相同的方式进行PF0012同源蛋白的表达和纯化，除了pET-TBA和祀T-MJA用作质粒，且在细菌细胞的破裂之后，热不稳定的蛋白通过在75°C高溫 处理10分钟而沉淀。因此，获得PF0012同源蛋白，TERMP_01877和蛋白MJ_0225。
[0067] 实施例1 :突变PF0012蛋白的制备 (1)pET-〇ptPF12-W77F(用于表达突变PF0012的质粒）的制备 制备编码蛋白PF0012的突变体的基因，其中蛋白PF0012(S