一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒，尤其设及用于评估ER/PR(+)肥R2(-)乳腺癌预后风险的 乳腺癌干细胞相关miRNA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有200万的新增乳腺癌患者。乳 腺癌是一类在分子水平上高度异质性的肿瘤，其在组织形态、免疫表型、生物学行为及治疗 反应上存在着极大的差异，传统病理TNM分期相同的患者对临床治疗的反应和预后可能有 很大的区别。
[0003]ER/PR(+)肥R2(-)型是乳腺癌最常见的分子亚型，人群发病率约为65%~70%。 在乳腺癌中预后最好，早期患者较多。与其他分子亚型乳腺癌相比，ER/PR(+)化r2(-)型乳 腺癌的预后较好，但仍有约为15~30%的5年复发转移率。根据传统的乳腺癌的?M临 床分期、病理报告W及实验室指标来评估疾病的严重程度，并不足W有效地筛选出运15~ 30%可能会发生复发转移的高危人群。因此，寻找更加有效的分子指标或基因模型来预测 ER/PR(+)肥R2 (-)型乳腺癌患者的预后，筛选出高危患者，指导临床治疗，是本发明的基本 出发点。
[0004] 乳腺癌干细胞具有放化疗及缺氧抵抗性、高致瘤性及高侵袭转移性等特征，在乳 腺癌的发生发展及复发转移中发挥了重要作用，是乳腺癌复发的重要原因，与乳腺癌的预 后密切相关。Ginestieretal.(CellStemCell.2008June10)和 Jiangetal.度reast CancerResearch2012)的研究证实，乳腺癌干细胞与邸阳性乳腺癌的预后密切相关。
[0005]miRNAs是一种包含约22个核巧酸的内源性非编码小RNA，可参与细胞的分化、增 殖和调亡过程，与肿瘤密切相关，一些miRNAs作为抑癌基因和原癌基因已被证实。研究还 证实，miRNAs参与调控乳腺癌干细胞的生物学功能，而在肿瘤组织中，乳腺癌干细胞相关 miRNAs的表达与肿瘤发生、发展和疗效、预后判断等密切相关，具有潜在的癌症预测和预后 价值。单个miRNA可作为肿瘤预后评估的分子标记物，但其特异性和敏感性低于现有的传 统预后评估指标，如?m分期等。
[0006] 传统的乳腺癌诊疗主要是根据?M临床分期、病理报告W及实验室指标来评估疾 病的严重程度和选择不同手段的综合治疗。现代医学模式的转变提示恶性肿瘤治疗应由基 于表型的循证医学模式向基于基因的个体化医学模式转变，如miRNAs基因预后模型。马俊 等化ancet化col2012)的研究发现，一个由5个miRNA构成的分子标签和脚1临床分期 联合构建的预后危险评分模型能很好地预测鼻咽癌患者的预后。罗俊航等化ancet化col 2013 ;)的研究则通过忍片筛查获得的6个miRNA检测结果结合NCCN指南的4个高危指标 构建新型预后模型，可W使II期结肠癌患者"被"高危的风险减低20%W上。运些研究结果 提示，将乳腺癌临床病理学预后模型与miRNA基因表达谱联合，有助于预测患者预后。
[0007] 石蜡标本组织中miRNA的含量较低，需要一个非常敏感而特异的检测方法；miRNA 引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可W利用，故引物及体系均需要优化过 程。目前miRNA的高通量检测一般采用忍片技术，成本高、特异性和敏感度有限，不能满足 临床上零星标本的实时检测需求；少数miRNA的实时检测多采用化qman探针法，部分已形 成商业化试剂盒，但成本和售价高昂。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于评估乳腺癌 预后风险的试剂盒，尤其是针对ER/PR(+)肥R2 (-)乳腺癌预后风险评估。
[0009] ER/PR表达阳性：即免疫组化结果显示ER/PR阳性（+~+++)，或ER/PR表达超过 1%。肥R2表达阴性：即免疫组化结果显示肥R2表达为（-)，或FI甜检测结果（-)。
[0010] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于评估乳腺癌预后风险的试 剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、 hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、 hsa-miR-200c_5p、hsa-miR-30c_5p、hsa-miR-181a_5p和hsa-let_7g-5p的扩增引 物；所述hsa-miR-21-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，所述 hsa-miR-22-5p的扩增引物序列如沈QIDNo. 3和沈QIDNo. 4所示，所述hsa-miR-7-5p 的扩增引物序列如SEQIDNo. 5和SEQIDNo. 6所示，所述hsa-miR-12化-5p的扩增 引物序列如SEQIDNo. 7和SEQIDNo. 8所示，所述hsa-miR-93-5p的扩增引物序列 如沈QIDNo. 9和沈QIDNo. 10所示，所述hsa-miR-182-5p的扩增引物序列如沈QID No. 11和沈QIDNo. 12所示，所述hsa-miR-200a-5p的扩增引物序列如沈QIDNo. 13和 沈QIDNo. 14所示，所述hsa-miR-200b-5p的扩增引物序列如沈QIDNo. 15和沈QID No. 16所示，所述hsa-miR-200c-5p的扩增引物序列如沈QIDNo. 17和沈QIDNo. 18 所示，所述hsa-miR-30c-5p的扩增引物序列如沈QIDNo. 19和沈QIDNo. 20所示， 所述hsa-miR-181a-5p的扩增引物序列如SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示，所述 hsa-let-7g-5p的扩增引物序列如沈QIDNo. 23和沈QIDNo. 24所示。
[0011] 优选地，所述试剂盒包括内参U6的扩增引物。
[0012] 优选地，所述内参U6的扩增引物如SEQIDNo. 25和SEQIDNo. 26所示。
[0013] 优选地，所述试剂盒包括用于配制逆转录反应体系的试剂。
[0014] 优选地，所述用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录酶、dNTP、Random primers、Oligo(dT)1218、RNasin、逆转录缓冲液和纯水。
[0015] 优选地，所述试剂盒包括用于配制定量PCR反应体系的试剂。
[0016] 优选地，所述用于配制定量PCR反应体系的试剂SYBRGreenI、无核酸酶纯水。
[0017] 优选地，所述试剂盒包括用于提取RNA的试剂。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒， 与现有技术相比，具有W下优点：
[0019] (1)通过大数据临床验证试验表明，本发明所述12个miRNAs化sa-miR-21-5p、 hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-200a_5p、hsa-miR-200b_5p、hsa-miR-200c_5p、miR-30c_5p、miR-181a_5p和 hsa-let-7g-5p)组合起来作为分子标记物，在ER/PR(+)肥R2(-)乳腺癌的预后风险评估方 面具有突出优势。运12个miRNAs组合分子标记物首次应用于ER/PR(+)肥R2(-)乳腺癌 miRNA检测试剂盒的开发，该乳腺癌miRNA检测试剂盒基于实时巧光定量PCR方法，可W实 现ER/PR(+)肥R2 (-)乳腺癌的预后评估，筛选有复发高风险的患者，指导临床个体化治疗， 并提高治疗的精准性。
[0020] 似本发明选择了 12个乳腺癌干细胞相关miRNAs化sa-miR-21-5p、 hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和 hsa-let-7g-5p)进行组合，开发成检测试剂盒，其检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成 本低、可W满足绝大对数肿瘤病人的检测需要，应用范围极广，经临床验证预测准确度高。
[0021] (3)针对乳腺癌组织标本中作为定量反应的内参，本发明引入稳定的人源RNA序 列U6作为内参对照RNA，并优化设计了针对U6的内参正向引物，极大提高了miRNA检测时 相对定量的准确度。
【附图说明】
[0022] 图1为采用本发明的试剂盒联合检测12miRNAs化sa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、 hsa-mi民一7-5p、hsa-mi民一125b-5p、hsa-mi民一93-5p、hsa-mi民一182-5p、hsa-mi民一200a-5p、 hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p)与TNM 分期的ROC曲线图；
[0023] 图2为采用本发明的试剂盒检测样本的临床预后与预测风险相关性散点图；
[0024] 图3为采用本发明的试剂盒检测样本的12个miRNAs化sa-miR-21-5p、 hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-200a_5p、hsa-miR-200b_5p、hsa-miR-200c_5p、miR-30c_5p、miR-181a_5p和 hsa-let-7g-5p)W及内参U6的溶解曲线峰图。
【具体实施方式】
[0025] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 本发明所述用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包 括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa