巧m离屯、45秒，弃掉废液。
[0084] 13.加入700 漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！），12, 00化pm离屯、 60秒，弃掉废液。
[0085] 14.加入500y1漂洗液RW，12, 000巧m离屯、60秒，弃掉废液。
[0086] 15.将吸附柱RA放回空收集管中，掀开离屯、柱盖，12, 00化pm离屯、2分钟，尽量除 去漂洗液，W免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
[0087] 16.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离屯、管中，加入30ylRNasefree water(事先在65-70°C水浴中加热效果更好），室溫放置2分钟，
[0088] 12, 00化pm离屯、1分钟。收集得到纯净RNA保存于-20°C或者更低。
[0089]度)cDNA的制备（RT)
[0090] 电泳检验RNA样本质量。
[0091]准备Mix1 (20yL体系）
[0092]
[0093] 分装于各管中。
[0094]加入2yLRNA样本（每管50-100化g)，在70°C加热5分钟W变性破坏RNA的二 级结构，结束后置于冰上2分钟。
[0095] 进行预变性时准备Mix2
[0096]
[0097]AMVR.T.指AMV逆转录酶。
[009引分装至各管预变性结束并冷却的管中。如有气泡，稍离屯、。
[009引室溫净置5分钟。
[0100] 根据逆转录酶工作溫度设定PCR仪，一般反应时间为1小时左右。将样品放入，进 行反应。反应结束时应有95°C5分钟的灭活步骤，将逆转录酶灭活，防止影响后续的PCR反 应。
[0101] 合成的cDNA第一链可被储存在-20°c。
[0102] (C)qRT-PCR检测：
[010引①按下列组成配制PCR反应液（10y1体系）。
[0104]
[0105]
[0106] ②反应条件。
[0107] 3StepPCR的反应条件：
[0108] 94°C 30sec
[0109] 55 ~65°C 30sec 30切cles
[0110] 72°Clmin/k:bp。
[0111] 值）风险值计算
[0112] 1、公式：Riskscore= 0. 252(statusofmiR-93)-〇. 314(statusof miR-200c)+0. 348(statusofmiR-181a)+0. 182(statusofmiR-182)-〇. 143(status ofmiR-7)-〇.I26(sta1:usofmiR-200a)+0.011(statusofmiR-21)+0.523(statusof let-7g)-〇. 794(statusofmiR-22)+0. 132(statusofmiR-30c)-〇. 137(statusof miR-200b)+0. 030(statusofmiR-12f5b);
[0113] 2、高危患者筛选：州t-off值为5. 44。样本化skscore<5. 44为低危，化sk score> 5. 44 为高危。
[0114] 实施例3 :本发明所述试剂盒的效果评价
[0115] 图1为采用本发明的试剂盒联合检测12miRNAs(miR-21、miR-22、miR-7、 miR-12f5b、miR-93、miR-182、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-30c、miR-18la和Let-7g) 与?M分期的ROC曲线图，结果显示，与传统的?M分期相比，12-miRNA-based模型具有更 好的敏感性和特异性。
[0116] 采用本发明的试剂盒检测样本的化skScore计算公式、12个miRNAs相关系数及 cut-off值如下所示。其中，miR-200c、miR-7、miR-22、miR-200b、miR-200a、与乳腺癌的预 后呈负相关，其余miRNA与乳腺癌的预后正相关。通过化skScore计算公式计算得到个体 患者的风险值大于或等于5. 44的为高危患者，小于5. 44的为低危患者。
[0117]
[0118]I?iskscore州toff: :5. 44 化i曲；risk> 5. 44,Lowrisk< 5. 44)
[0119]
[0120]上述 miR-21 指 hsa-miR-21-5p，miR-22 指 hsa-miR-22-5p，miR-7 指 hsa-miR-7-5p，miR-125b 指 hsa-miR-12化-5p，miR-93 指 hsa-miR-93-5p，miR-182 指 hsa-miR-182-5p，miR-200a 指 hsa-miR-200a-5p，miR-200b 指 hsa-miR-200b-5p，miR-200c 指 hsa-miR-200c-5p，miR-30c 指 miR-30c-5p，miR-181a 指 miR-181a-5p，Let-7g 指 hs曰-let-7g-5p〇
[0121] 图2为采用本发明的试剂盒检测样本的临床预后与预测风险相关性散点图，结果 显示，在123例样本中，运用本发明预测出的为低风险的基本无5年复发转移，而出现5年 复发转移的样本均为本发明预测出的高风险病例。
[0122] 图3为采用本发明的试剂盒检测样本的12个miRNAs化sa-miR-21-5p、 hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-200a_5p、hsa-miR-200b_5p、hsa-miR-200c_5p、miR-30c_5p、miR-181a_5p和 hsa-let-7g-5p)W及内参U6的溶解曲线图。12个miRNAs及U6的溶解曲线及溶解峰图， 均呈单峰，提示PCR扩增产物特异性（纯度）高，基本不存在非特异性扩增产物。
[0123] 最后所应当说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
【主权项】
1. 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 hsa-miR-21_5p、hsa-miR-22_5p、hsa-miR-7_5p、hsa-miR-125b_5p、hsa-miR-93_5p、 hsa-miR-182_5p、hsa-miR-200a_5p、hsa-miR-200b_5p、hsa-miR-200c_5p、 hsa-miR-30c_5p、hsa-miR-181a_5p和hsa_let-7g_5p的扩增引物；所述hsa-miR-21_5p 的扩增引物序列如SEQIDNo.I和SEQIDNo. 2所示，所述hsa-miR-22-5p的扩增 引物序列如SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示，所述hsa-miR-7-5p的扩增引物序列 如SEQIDNo. 5和SEQIDNo. 6所示，所述hsa-miR-125b-5p的扩增引物序列如SEQ IDNo. 7和SEQIDNo. 8所示，所述hsa-miR-93-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 9和 SEQIDNo. 10 所示，所述hsa-miR-182-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 11 和SEQID No. 12 所示，所述hsa-miR-200a-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 13 和SEQIDNo. 14 所示，所述hsa-miR-200b-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 15和SEQIDNo. 16所 示，所述hsa-miR-200c-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 17和SEQIDNo. 18所示， 所述hsa-miR-30c-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 19和SEQIDNo. 20所示，所 述hsa-miR-181a-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 21和SEQIDNo. 22所示，所述 hsa-let-7g-5p的扩增引物序列如SEQIDNo. 23 和SEQIDNo. 24 所示。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括内参U6的扩增引物。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参U6的扩增引物如SEQID No. 25 和SEQIDNo. 26 所示。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于配制逆转录反应 体系的试剂。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述用于配制逆转录反应体系的试剂 包括逆转录酶、dNTP、Randomprimers、Oligo(dT) 12 18、RNasin、逆转录缓冲液和纯水。6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于配制定量PCR反应 体系的试剂。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于配制定量PCR反应体系的试剂 SYBRGreenI、无核酸酶纯水。8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于提取RNA的试剂。
【专利摘要】本发明提供了一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒，通过大数据临床验证试验表明，本发明所述12个miRNAs组合起来作为分子标记物，在ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌的预后风险评估方面具有突出优势。这12个miRNAs组合分子标记物首次应用于ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌miRNA检测试剂盒的开发，该乳腺癌miRNA检测试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，可以实现ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌的预后评估，筛选有复发高风险的患者，指导临床个体化治疗，并提高治疗的精准性。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105200043
【申请号】CN201510366235
【发明人】宋尔卫, 龚畅, 谭维格
【申请人】宋尔卫, 龚畅, 谭维格
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年6月26日