普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高普鲁兰酶比酶活和热稳定性的普鲁兰酶产酶基因、含有该基因的载体、及该载体在普鲁兰酶制备中的应用。
【背景技术】
[0002]淀粉是地球上比较丰富的生物质资源，它的主要组成单位是葡萄糖。淀粉除了直接作为食品原料外，还可通过化学或生物的方法生成其他有价值的物质，包括:氨基酸、葡萄糖浆、有机酸、酒精等。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的混合物，其中直链淀粉是由葡萄糖单体通过α -1, 4糖苷键形成的，支链淀粉的主链是由直链淀粉组成，其分支处则由α_1，6糖苷键形成。
[0003]工业应用淀粉中支链淀粉含量高达70%?95%，其中α-1，6键的含量是4%?5%，然而大多数的淀粉酶对α -1, 6糖苷键均不起作用，α -淀粉酶和糖化酶联合使用时也不能达到对淀粉的完全分解，因此α -1, 6糖苷键的水解效率直接影响到工业淀粉的利用率。
[0004]普鲁兰酶是一种脱支酶，能催化普鲁兰糖中α_1，6糖苷键的水解。普鲁兰酶可以专一性切下支链淀粉的整个支链，从而形成直链淀粉，因此普鲁兰酶在淀粉工业中具有十分重要的作用。
[0005]根据普鲁兰酶作用的底物特异性，可将普鲁兰酶分为两类:1型普鲁兰酶(EC.3.2.1.41)，可以专一性水解寡糖分支处和普鲁兰糖中的α -1, 6糖苷键，形成直链多糖、麦芽三糖；II型普鲁兰酶(EC.3.2.1.1/41)，又称淀粉普鲁兰酶，不仅可以水解寡糖分支处、普鲁兰糖中的α-1，6糖苷键，同时也可水解淀粉中的α-1，4糖苷键。
[0006]普鲁兰酶在工业上的应用非常广泛，但是大部分普鲁兰酶的酶活不高，或者不能适应酸性高温的作用环境，这些因素严重的制约了普鲁兰酶的工业应用。
[0007]我国对普鲁兰酶的研究始于20世纪70年代，起步相对较晚。目前国内市场对普鲁兰酶的需求量很大，主要依赖进口，价格昂贵，因此，国内掀起了一股研究普鲁兰酶的热潮。由于从自然界筛选普鲁兰酶产生菌具有很大的盲目性，因此越来越多的科研工作者把重点放在了酶的固定化、基因工程、蛋白质工程上面，并取得了一定的成果。
【发明内容】
[0008]本发明目的是提供一种普鲁兰酶产酶基因，同时本发明提供了一种含有该基因的载体，将该载体用于制备普鲁兰酶后，所制备的普鲁兰酶具有较好地热稳定性和比酶活，显现出了较好地潜在应用价值。
[0009]本发明的技术方案详细介绍如下。
[0010]一种普鲁兰酶产酶基因，该基因含有3156个碱基，与保藏编号CGMCC N0.10357的变栖克雷伯氏菌ΗΝ7 {Klebsiella variicola HN7)的野生型普鲁兰酶基因相比，其信号肽N端缺少31个氨基酸对应的碱基序列，具体序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0011]上述普鲁兰酶产酶基因所编码的普鲁兰酶PU1A-N31，含有1052个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]含有普鲁兰酶产酶基因的载体，通过下述步骤制备而成:
(1)提取基因组DNA，提取变栖克雷伯氏菌HN7{Klebsiella variicola HN7)的基因组 DNA ；
(2)PCR扩增，具体为，以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，设计如下引物序列，PCR扩增变栖克雷伯氏菌HN7的普鲁兰酶(pulA)基因，扩增产物切胶纯化后4°C保存备用；
引物序列设计如下:
上游引物 F: 5' -TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT -3'，
下游引物 R: 5' -AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3'；
需要说明的是，上游引物F中的CATATG部分序列为Nde I酶切位点，Nde I识别位点中的ATG为起始翻译密码子，下游引物R中的GCGGCCGC部分序列为Abi I酶切位点；
(3)构建pMD19-pulA质粒，具体为，将步骤(2)中PCR扩增产物与pMD19_T质粒16°C下连接16h，然后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，培养12~16h ;提取pMD19_pulA质粒，测序验证；
(4)构建pET21a- pulA表达载体，具体为，
将(4)中测序正确的pMD19-pulA质粒和pET21a在37°(:进行^￡?1、Notl双酶切16h，胶回收目的条带；
将上述胶回收产物16°C条件下，T4 DNA连接酶连接16h ；
连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，提取质粒进行测序验证；
(5)反向PCR，以(4)中测序正确的表达载体pET21a-pulA为模板，设计引物，反向PCR扩增获得去信号肽N端减少31个氨基酸基因序列的线性序列产物，线性序列产物切胶纯化后4 C保存备用；
引物序列设计如下:
上游引物 F-N31:5' -CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3'，
下游引物 R-N31:5' -GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3'；
(6)酶连获得pET21a-pulA-N31表达载体，具体为，将步骤(5)中所获得线性序列产物用T4 DNA连接酶进行连接构建pET21a-pulA-N31表达载体，然后用Dpn I酶对酶连体系进行酶切处理，以去除体系内不必要物质。
[0013]所述含有普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用，具体步骤如下:
(I)热激转化构建普鲁兰酶截短突变体工程菌，具体为，将所构建的pET21a-pulA-N31
表达载体(或连接产物)用热激法转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，复苏后将感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，培养12~16h ;
培养结束后，挑取LB平板上的阳性单克隆菌落，用菌落PCR筛选阳性克隆。同时接种到Amp终浓度为0.lmg/mL的液体LB培养基中，37°C、220 r/min培养12~16 h ;用solarb1质粒提取试剂盒提取质粒，并进行双酶切验证。
[0014](2)诱导表达，对步骤(I)中鉴定正确的阳性克隆接种到Amp和IPTG的终浓度分别是0.lmg/mL和0.6mmol/L的LB培养基中，进行诱导表达；
(3)获得酶pulA-N31，具体为， 取步骤(2)中菌液，4°C、6000 r/min、离心lOmin，收集菌体，加入I XE/ff (pH7.0)使菌体充分混勾，放置冰上进行超声波破碎(3s X 4s X 99次)，4°C、6000 r/min，离心30min，将上清4°C保存；
将上述上清分装到1.5mL的离心管中，4°C、12000 r/min离心30min，弃沉淀，上清液即为粗酶液；
Co2+螯合琼脂糖凝胶即可纯化该粗酶液。
[0015]上述含有普鲁兰酶产酶基因的载体、及含有普鲁兰酶产酶基因的载体在普鲁兰酶制备中的应用的过程，也即普鲁兰酶PU1A-N31的制备过程。
[0016]由于从自然界筛选普鲁兰酶产生菌具有很大的盲目性，而且筛到的普鲁兰酶的酶活普遍较低，温度和PH的作用范围也不能满足工业生产的需要。发明提供了一种普鲁兰酶产酶基因，同时利用基因工程操作手段提供了一种含有该基因的载体，将该载体用于普鲁兰酶制备后，与原始出发菌株变栖克雷伯氏菌HN7 {Klebsiella variicola HN7)相比，所制得的普鲁兰酶的比酶活、热稳定性以及对普鲁兰糖的底物亲和能力和催化效率都有了极大提高，显现出较好地应用前景。
【附图说明】
[0017]图1为普鲁兰酶基因pulA的PCR扩增图，其中M是λ HindIII marker，I是pulA基因的PCR产物；2-7是基因组DNA ；
图 2 为重组质粒 pMD19_pulA，其中 M 是 λ HindIII marker，I 是 pMD19- pulA，2 是pMD19-TVector ；
图3为重组质粒pMD19_pulA的TVfafe 1、Abi I双酶切图，其中M是λ HindIII marker,
I 是 pMD19_ pulA Nde 1、Not\ 的双酶切；
图 4 为重组质粒 pET21a-pulA 图，其中 M 是 λ HindIII marker，I 是 pET_21a，2-4 是pET21a-pulA ；
图5为pET21a-puA-N31的PCR产物电泳检测图，其中M是λ Hind III marker, I是线性 pET21a-pulA，2 线性是 pET21a_puA_N31 ;
图6为SDS-PAGE检测pulA和pulA_N31胞内可溶性粗酶，其中M是protein marker,I 是 pulA，2 是 pulA_N31 ；
图7为SDS-PAGE检测pulA和pulA_N31胞内可溶性纯酶，其中M是proteinmarker, I 是 pulA，2 是 pulA_N31 ；
图8为pulA和pulA-N31的最适pH ；
图9为pulA和pulA-N31的最适温度；
图10为pulA和pulA-N31半衰期；
图11为pulA和pulA-N31的Hanes-Woolf曲线(普鲁兰糖作为底物)。
【具体实施方式】
[0018]在介绍具体实施例前，首先对实施例中所用到的部分原料和试剂简要介绍说明如下，未说明内容以现有技术中常用原料和试剂为准。
[0019]实验菌株:本申请中所用变栖克雷伯氏菌HN7