(Klebsiella KariicoJa HN7)目前保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC N0.10357 ;由于该菌株是申请人自行筛选获得，因而申请人留有相关菌株的备份。
[0020]微生物培养所用培养基
斜面保藏培养基(w/v ):糯米粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，KH 2P04 0.05%，MgSO4.7H20 0.01%，琼脂 2.0%，pH 6.0 ；
种子培养基(w/v):蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 6.0 ；
产酶培养基(w/v):糯米粉 0.5%，蛋白胨 0.5%，KH2PO4 0.05%，MgSO4.7H20 0.01%，pH自然；
LB培养基(w/v):胰蛋白胨I %，酵母提取物0.5 %，NaCl I %，(固体培养基含1.5%琼脂粉)；
以上培养基均需要121°C、高压蒸汽灭菌30min。
[0021]部分试剂与酶
普鲁兰糖为东京化成工业株式会社产品；
支链淀粉为Sigma公司产品；
玉米淀粉是阿拉丁公司产品；
琼脂糖胶DNA产物回收试剂盒、牛血清蛋白(BSA)、甘氨酸、EDTA、氨苄青霉素Amp、Tris、SDS、异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、可溶性淀粉、酵母提取物(YeastExtract)、胰蛋白胨(Trytone)、琼脂糖(Agarose)均购自上海生工生物工程有限公司；基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购买于Solarb1 ;
DNA分子量Marker ( λ HindIII)、高分子量蛋白质MarkeiNyWe I ^ Not\、T4 DNA Ligase(连接酶)、PMD19-T载体和Co2+树脂都购买于TaKaRa公司；pET21a载体购买于优宝生物；
丙三醇、冰乙酸、氯化钙、考马斯亮蓝、甲醇、无水乙醇、柠檬酸、氯化钠、磷酸氢二钠等为分析纯，购买于河南金图化学试剂有限公司；
Q5超保真DNA聚合酶，限制性内切酶Dpn I从NEB购买；
相关引物由北京华大基因公司合成提供；
相关基因测序由金唯智生物技术公司完成。
[0022]实施例1
本发明所提供的普鲁兰酶产酶基因，与保藏编号CGMCC N0.10357的变栖克雷伯氏菌HN7 {Klebsiella variicola HN7)的野生型普鲁兰酶基因相比，其去信号肽N端缺少31个氨基酸对应的基因序列，具体序列如序列表所示。
[0023]由于本发明的普鲁兰酶产酶基因与变栖克雷伯氏菌HN7 (Klebsiella variicolaHN7)的野生型普鲁兰酶基因较为接近，因而申请人以变栖克雷伯氏菌HN7 {Klebsiellavariicola HN7)野生型为基础，同时构建了含有普鲁兰酶产酶基因的载体，具体构建过程介绍如下。
[0024](I)提取基因组DNA，具体为，将试管中斜面保藏培养的变栖克雷伯氏菌HN7{Klebsiella variicola HN7)接种到种子培养基中，收集菌体，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，然后进行琼脂糖凝胶验证，电泳结果如图1所示。
[0025](2 ) PCR扩增，具体为， 首先设计引物序列设计如下:
上游引物 F: 5' -TATGATCATATGCTCAGATATACCTGTCATGCCCTATT -3'，
下游引物 R: 5' -AACTCTGCGGCCGCTTTACTGCTCACCGGCAGG-3'；
需要说明的是，上游引物F中的CATATG部分序列为Nde I酶切位点，Nde I识别位点中的ATG为起始翻译密码子，下游引物R中的GCGGCCGC部分序列为Abi I酶切位点；
以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，PCR扩增变栖克雷伯氏菌HN7的普鲁兰酶(pulA)基因，25 μ L PCR扩增体系设置如下:
Mix，12.5 yL ；
上游引物 F (25ymol/L),0.5yL ；
下游引物 R (25ymol/L),0.5yL ；
步骤(I)中所提取DNA模板，2 μ L ; ddH20，9.5 μ L ；
PCR反应条件:95°C预变性3min，95°C变性30s、55°C退火lmin、72°C延伸3min，共30个循环，72°C延伸1min ；
扩增产物进行琼脂糖凝胶验证，结果如图1所示，切胶纯化后4°C保存备用。
[0026](3)构建pMD 19-pul A质粒，具体为，
将步骤(2)中PCR扩增产物与pMD19-T质粒16°C下连接16h，10 μ L连接体系设置如下:
纯化后的pulA，5.0 μ L ； pMD19_TVector，0.5 μ L ；
Solut1n I ? 4.5 μ L ；
将连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；
转化产物接种到Amp终浓度为0.lmg/mL的液体LB中，37°C、220 r/min培养12~16 h ；12000 r/min离心2min收集菌体，按照Solarb1质粒小提试剂盒的说明书提取质粒，进行琼脂糖胶验证，电泳结果如图2所示，然后送金唯智生物技术公司测序验证。验证结果表明所制备的pMD19-pulA质粒序列符合预期，构建正确。
[0027](4)构建pET21a - pulA表达载体，具体为，
将步骤(3)中测序正确的pMD19-pulA质粒和pET21a在37°C进行Nde 1、Notl双酶切16h，酶切体系设置如下:
质粒模板，14.0yL ;
Ndel ,1.0 ViL ；
Notl，1.0 μ L ;
BSA,2.0yL；
10ΧΗ，5.0yL；
酶切结果如图3所示，胶回收目的条带；
将上述胶回收产物16°C条件下，T4 DNA连接酶连接16h，酶连体系设置如下:
10XT4DNA ligase buffer,1.0 μ L ；
双酶切纯化的pulA，6.0yL;
双酶切纯化的pET-21a ( + ),2.0yL；T4 DNA 连接酶，1.0 μ L ;
连接产物转化大肠杆菌BL21感受态细胞，提取质粒进行琼脂糖胶验证，结果如图4所示，然后送金唯智生物技术公司测序验证。验证结果表明载体序列构建正确。
[0028](5)反向PCR，具体为，首先设计引物序列设计如下:
上游引物 F-N31:5' -CATGCTCTAGATGTGATAACAGCTCTTCCTCTTCACC-3'，
下游引物 R-N31:5' -GATGTGGTCGTCCGCTTACCG-3'；
以(4)中测序正确的表达载体pET21a-pulA为模板，反向PCR扩增获得去信号肽N端去除31个氨基酸基因序列的线性序列产物，50 μ L PCR扩增体系设计如下:
Q5 酶(2υ/μυ，0.5yL ;
DNA模板(步骤4中所制备pET21a-pulA载体)，LOyL ；
上游特异引物F，2.5 yL ;
下游特异引物Rn31，2.5yL;
5XQ5反应缓冲液，10.0yL;
2.5mM dNTPs，4.0 yL ；ddH20，29.5 μ L ;
PCR反应条件:98°C预变性30S;98°C变性20s、66°C退火25s、72°C延伸6 min，30个循环；72°C延伸2min ；
然后进行琼脂糖胶验证，结果如图5所示。按琼脂糖胶DNA产物回收试剂盒说明书将PCR扩增产物回收纯化，4°C保存备用。
[0029](6)酶连获得pET21a-pulA_N31表达载体，具体为，
将步骤(5)中所获得线性序列产物16 0C用T4 DNA连接酶连接16h，构建pET21a-pulA-N31表达载体，然后65°C灭活30min，其酶连体系设置如下:
PCR纯化后基因(步骤5中回收后纯化产物)，2.0 μ L ;
Τ4 DNA ligase，1.0 yL ；
10XT4 DNA Ligase bufffer,1.0 μ L ;ddH20，6.0 μ L ；
对上述酶切体系用雄w I对酶连体系酶切处理，用于消解模板；其酶切体系设置如下: 上述酶连体系，10.0yL ;
10ΧΝΕΒ 缓冲液，5.0yL;
Dpn I，2.0 μ L ; ddH20，33.0 μ L ;
反应条件:37 °C酶切3h，80 °C灭活20min，4 °C保存备用，此时即为含有pET21a-pulA-N31表达载体的混合物。
[0030]实施例2
将实施例1所制备的含有普鲁兰酶产酶基因的载体用于普鲁兰酶制备中，具体步骤如下:
(I)热激转化构建普鲁兰酶截短突变体工程菌，具体为，
将实施例1所构建的pET21a-pulA-N31表达载体用热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，复苏后将感受态细胞涂布在含有氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，培养；详细为:
本实施例为操作简便期间，直接将?ο μ L连接产物加入到200 μ L大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻吹打均匀，冰置30min，然后42°C热激90s，再冰置90s，复苏后将感受态细胞涂布在Amp终浓度为0.lmg/mL的LB平板上，37°C培养12