固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域中固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法。
【背景技术】
[0002]錯蚁轮枝菌(Verticillium Iecanii)可用于保护地蔬菜病虫害防治，既可寄生于白粉虱、蚜虫、蓟马等害虫，还可以寄生于锈病、立枯病病菌、白粉病等植物病菌，并且遗传稳定性较好，对人、作物、家畜、禽均未发现有毒害，对天敌昆虫安全，因此在防治保护地蔬菜病虫害中具有重要潜力。
[0003]作为微生物杀虫剂，蜡蚧轮枝菌的有效成分是分生孢子，目前只能通过固态发酵生产分生孢子，由于固态发酵生产该菌的分生孢子的过程中菌体生长、营养物质的传输及代谢物的分泌等均匀性差，难以精确检测及控制发酵参数，较难达到大规模产业化的要求。过去人们常采用液体(发明专利:一种蜡蚧轮枝菌及其培养方法与应用，专利号:ZL200410058017.9)生产，但是产品形式是芽生孢子，不利于长期保存，严重限制了产业化生产。以往的固体发酵多以粮食大米或小米作为基质(如发明专利:蜡蚧轮枝菌及其培养方法与应用，专利号:ZL 200410058016.4)生产蜡蚧轮枝菌，发酵周期长，而且生产的固体发酵基质为大米，不但生产成本高，而且也会消耗粮食，也不利于商品化生产。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是如何低成本的大规模生产蜡蚧轮枝菌(Verticillium Iecanii)分生抱子。
[0005]为解决上述技术问题，本发明首先提供了以低廉的农副产品为基质的固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法。
[0006]本发明所提供的固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法，包括下述a)和b):
[0007]a)将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中进行培养，得到蜡蚧轮枝菌培养物；
[0008]b)收集所述蜡蚧轮枝菌培养物，得到蜡蚧轮枝菌分生孢子；
[0009]所述发酵培养基为由发酵基质和营养物质组成的无菌培养基，所述发酵培养基中所述发酵基质和所述营养物质的质量比为(20-30):3 ;所述发酵基质由麦麸、豆柏、稻壳和水组成，所述发酵基质中所述麦麸、所述豆柏、所述稻壳和水的质量比为3: (0.5-2): (0.5-2): (2-4);所述营养物质由葡萄糖、酵母粉和玉米淀粉组成，所述营养物质中所述葡萄糖、所述酵母粉和所述玉米淀粉质量比为(4-6):2: (4-6)。
[0010]所述麦麸可为小麦麸。所述豆柏可为大豆柏。所述稻壳可为水稻壳。所述葡萄糖具体可为国药集团化学试剂有限公司产品。所述酵母粉具体可为北京双旋微生物培养基制口 I章口叩；广PPtO
[0011]上述方法中，所述发酵培养基中所述发酵基质和所述营养物质的质量比可为25:3 ;所述发酵基质中所述麦麸、所述豆柏、所述稻壳和水的质量比可为3:1:1:3 ;所述营养物质中所述葡萄糖、所述酵母粉和所述玉米淀粉质量可比为5:2:5。
[0012]上述方法中，所述将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中可为将含有蜡蚧轮枝菌分生孢子的孢子悬浮液喷射接种于所述发酵培养基上。
[0013]上述方法中，所述喷射接种可用无菌喷雾器进行。
[0014]上述方法中，所述孢子悬浮液可为将所述蜡蚧轮枝菌分生孢子用无菌水悬浮得到的液体。
[0015]上述方法中，所述蜡蚧轮枝菌分生孢子可为将所述蜡蚧轮枝菌进行活化得到的分生孢子。
[0016]上述方法中，所述将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中，所述蜡蚧轮枝菌分生孢子与所述发酵培养基的比例可为(1-3) X 18Cfu:0.1kg，如2 X 18Cfu:0.1kg0
[0017]上述方法中，所述培养的温度为20-25 °C;所述培养的湿度为85-95%;所述培养的时间为9_11天。
[0018]所述20-25°C具体可为23 °C。所述85-95%具体可为90%。所述9_11天具体可为10天。
[0019]上述方法中，所述培养可在无菌环境下进行。所述无菌环境具体可为无菌发酵室。所述无菌发酵室的通风时间可为每小时15分钟。
[0020]上述方法中，所述收集所述蜡蚧轮枝菌培养物可包括下述I)和2):
[0021]I)将所述蜡蚧轮枝菌培养物进行干燥，得到干燥后的培养物；
[0022]2)粉碎所述得到干燥后的培养物，得到含有蜡蚧轮枝菌分生孢子的孢子粉。
[0023]上述方法中，所述收集所述蜡蚧轮枝菌培养物还可包括将所述含有蜡蚧轮枝菌分生孢子的孢子粉过筛子的步骤。
[0024]上述方法中，所述筛子具体可为100目筛子。
[0025]上述方法中，所述干燥的温度可为28_32°C ;所述干燥的时间可为36_60小时。
[0026]上述方法中，所述28-32°C具体可为30°C。所述36-60小时具体可为48小时。
[0027]上述方法中，所述蜡蚧轮枝菌具体可为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为CGMCC N0.1187 的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii) Verle Bj085_l。
[0028]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述方法在制备防治植物病害和/或植物虫害产品中的应用。
[0029]上述应用中，所述植物病害具体可为植物锈病、立枯病或白粉病；所述植物虫害具体可为白粉虱、蚜虫或蓟马。
[0030]为解决上述技术问题，本发明还提供了所述发酵培养基。
[0031]实验证明，本发明的固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法可以进行大规模生产錯蚁轮枝菌(Verticillium lecanii)分生孢子并降低生产成本、缩短生产时间:本发明的固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法中采用喷雾接种法，使用由固体发酵得到分生孢子直接制备而成的接种液，不仅能使孢子均匀生长于发酵基质，充分提高基质生物质能的转化率，将2X 19Cfu初始蜡蚧轮枝菌分生孢子在Ikg固态发酵培养基上培养后可获得5X 19Cfu蜡蚧轮枝菌分生孢子/克孢子粉，大幅节约了原始接种量，降低了接种液的生产成本及生产时间；本发明的固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法所用原料取材方便，质优价廉，充分保证了碳源、氮源、营养条件的供给，并且生产过程无废气、废渣、废水的排放，绿色环保。
【具体实施方式】
[0032]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0033]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0034]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]下述实施例中的錯蚁轮枝菌(Verticillium lecanii)记载在中国专利CN1274807 C 中。
[0036]下述实施例中的葡萄糖为国药集团化学试剂有限公司产品；酵母粉为北京双旋微生物培养基制品厂产品。
[0037]下述实施例中的喷雾器为10ml容量的喷雾器。
[0038]下述实施例中的粉碎机为北京环亚天元机械技术有限公司产品，型号为HY-04B。
[0039]实施例1、固态发酵生产錯蚁轮枝菌分生孢子
[0040]一、发酵培养基的制备
[0041 ] 本实施例用到的发酵培养基由发酵基质和营养物质组成，其中发酵基质和营养物质的质量比为25:3 ;发酵基质由麦麸、豆柏、稻壳和水组成，发酵基质中小麦麸、大豆柏、水稻壳和水的质量比为3:1:1:3 ;营养物质由葡萄糖、酵母粉和玉米淀粉组成，营养物质中葡萄糖、酵母粉和玉米淀粉质量比为5:2:5。将发酵培养基分装到耐高温灭菌袋中，在121°C条件下湿热灭菌20分钟得到无菌发酵培养基。发酵培养基中，小麦麸、大豆柏、稻壳、葡萄糖、酵母粉和玉米淀粉的质量均以