干重计。
[0042]二、发酵室的准备
[0043]体积为20m2(底面积)X3m(高)的小型发酵车间，该发酵室生产能力为每批次30
千克发酵物。
[0044]发酵室的消毒灭菌:将称好的高锰酸钾放入容器内，然后注入甲醛溶液，立即关闭房门，熏蒸24小时后方可进入室内工作，以后每天进行半小时紫外线消毒。每立方米空间用甲醛溶液10ml，高锰酸钾5g。
[0045]发酵室的温度:23 °C ± I °C。
[0046]发酵室的湿度控制:90 % ± 2 %。
[0047]发酵室的通气控制每小时通气15分钟，通过发酵室顶部通风扇进行调节。
[0048]三、分生孢子悬浮液的制备
[0049]将原始菌种錯蚁轮枝菌(Verticilliumlecanii)Verle Bj085_l CGMCC N0.1187)在PDA培养基划线在23°C、相对湿度90%的条件下倒扣培养7-10天，收集分生孢子，将得到的分生孢子悬浮在无菌水中，得到分生孢子悬浮液，分生孢子悬浮液的浓度为I X 18Cfu分生孢子/ml分生孢子悬浮液。
[0050]四、固态发酵生产錯蚁轮枝菌分生孢子
[0051]向镂空的无菌塑料箱(高度为20cm)中添加步骤一的无菌发酵培养基，每个塑料箱Ikg无菌发酵培养基，无菌发酵培养基厚度约2cm，得到装有无菌发酵培养基的接种箱。将步骤三的分生孢子悬浮液装至无菌喷雾器中，并用无菌喷雾器将分生孢子悬浮液喷射接种于接种箱的无菌发酵培养基中，每千克无菌发酵培养基接种20mL分生孢子悬浮液，接种后将无菌发酵培养基稍加搅拌，喷射接种时喷雾器的壶嘴距离接种箱中无菌发酵培养基的高度低于20cm，接种结束后得到接有蜡蚧轮枝菌分生孢子的接种箱。将接有蜡蚧轮枝菌分生孢子的接种箱置入按照步骤二准备好的发酵室中，培养10天，得到含有蜡蚧轮枝菌培养物的接种箱。
[0052]将含有蜡蚧轮枝菌培养物的接种箱置于烘箱中干燥处理48小时，得到干燥后的培养物；将干燥后的培养物在无菌密封袋中捏碎，得到粗处理的干燥培养物，将粗处理的干燥培养物在粉碎机中粉碎I分钟得到粉状物，将粉状物过100目筛子，得到含有蜡蚧轮枝菌分生孢子的孢子粉(简称孢子粉)。孢子粉可装在密封袋中储存于0°C -10°C干燥环境中。
[0053]孢子粉中蜡蚧轮枝菌分生孢子的检测，具体方法如下:称取5g孢子粉，加入盛有10ml无菌水三角瓶中，加入0.01%吐温-80，放入5颗玻璃珠震荡3_5min，以充分将孢子从基质中分离出来，然后用两层纱布进行过滤，将得到的滤液置于血球计数板上，计数分生孢子。孢子产量单位:每克孢子粉中的孢子数。结果表明，每克孢子粉中含有5.0X 109±0.2X 19Cfu蜡蚧轮枝菌分生孢子。
[0054]上述固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法中，将2X 19Cfu的初始蜡蚧轮枝菌分生孢子在无菌发酵培养基上培养10天后可获得5.0X 19 ± 0.2 X 19Cfu蜡蚧轮枝菌分生孢子/g孢子粉。
[0055]在中国发明专利CN 1274808 C中记载了一种蜡蚧轮枝菌(Verticilliumlecanii)Verle BJ085-1 CGMCC N0.1187)的培养方法:将菌种接种至液体培养基中，在23-25Γ下培养得到蜡蚧轮枝菌产品，该液体培养基含有1-3%重量的蔗糖，2-4%重量的淀粉，2-4%重量的啤酒酵母，0.1-0.3%重量的碳酸钙，余量为水。通过该方法得到的蜡蚧轮枝菌产品形式是芽生孢子，不利于长期保存，严重限制了产业化生产。
[0056]在中国发明专利CN 1274807 C中记载了一种蜡蚧轮枝菌(Verticilliumlecanii)Verle BJ085-1 CGMCC N0.1187)的培养方法:首先将大米煮成半熟，风干后装于30 X 20cm耐高压塑料袋中，每袋装200克，在100°C和15镑压力条件下灭菌0.5小时。将活化后的錯蚁轮枝菌(Verticillium lecanii)Verle Bj085_l CGMCC N0.1187)用无菌水稀释至浓度为17孢子/毫升孢子悬浮液，无菌条件下将150毫升悬浮液接种在灭菌处理后的大米上，在23-25 °C、相对湿度为85-90%的条件下培养20天。该方法生产蜡蚧轮枝菌的发酵周期长，而且用于米作为发酵基质，不但生产成本高，而且也会消耗粮食，也不利于商品化生产。
[0057]本发明提供的以低廉的农副产品为基质的固态发酵快速生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法，显著降低了生产成本，更利于商品化生产。
【主权项】
1.固态发酵生产錯蚁轮枝菌分生孢子的方法，包括下述a)和b): a)将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中进行培养，得到蜡蚧轮枝菌培养物； b)收集所述蜡蚧轮枝菌培养物，得到蜡蚧轮枝菌分生孢子； 所述发酵培养基由发酵基质和营养物质组成，所述发酵培养基中所述发酵基质和所述营养物质的质量比为(20-30):3 ;所述发酵基质由麦麸、豆柏、稻壳和水组成，所述发酵基质中所述麦麸、所述豆柏、所述稻壳和水的质量比为3: (0.5-2): (0.5-2): (2-4);所述营养物质由葡萄糖、酵母粉和玉米淀粉组成，所述营养物质中所述葡萄糖、所述酵母粉和所述玉米淀粉质量比为(4-6):2: (4-6)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基中所述发酵基质和所述营养物质的质量比为25:3 ;所述发酵基质中所述麦麸、所述豆柏、所述稻壳和水的质量比为3:1:1:3 ;所述营养物质中所述葡萄糖、所述酵母粉和所述玉米淀粉质量比为5:2:5。3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于:所述将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中为将含有蜡蚧轮枝菌分生孢子的孢子悬浮液喷射接种于所述发酵培养基上。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中，所述錯蚁轮枝菌分生孢子与所述发酵培养基的比例为(1-3) X 108cfu:0.1kg05.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述培养的温度为20-25°C;所述培养的湿度为85-95% ;所述培养的时间为9-11天。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述收集所述蜡蚧轮枝菌培养物包括下述I)和2): 1)将所述蜡蚧轮枝菌培养物进行干燥，得到干燥后的发酵物； 2)粉碎所述得到干燥后的发酵物，得到含有蜡蚧轮枝菌分生孢子的孢子粉。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述干燥的温度为28-32°C;所述干燥的时间为36-60小时。8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述蜡蚧轮枝菌为蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)Verle Bj085_l CGMCC N0.1187。9.权利要求1-8中任一所述的方法在制备防治植物病害和/或植物虫害产品中的应用。10.权利要求1或2中任一所述发酵培养基。
【专利摘要】本发明公开了固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法。本发明所提供的固态发酵生产蜡蚧轮枝菌分生孢子的方法，包括：a)将蜡蚧轮枝菌接种于发酵培养基中进行培养，得到蜡蚧轮枝菌培养物；b)收集蜡蚧轮枝菌培养物，得到蜡蚧轮枝菌分生孢子；发酵培养基由质量比为25:3的发酵基质和营养物质组成；发酵基质由质量比为3:1:1:3的麦麸、豆粕、稻壳和水组成；营养物质由质量比为5:2:5的葡萄糖、酵母粉和玉米淀粉组成。本发明的方法可以大规模生产蜡蚧轮枝菌分生孢子并降低生产成本、缩短生产时间。
【IPC分类】A01P3/00, C12R1/645, A01N63/04, C12N3/00, A01P7/04
【公开号】CN105219692
【申请号】CN201510741208
【发明人】张龙, 张奥川
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月4日