鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种从水生生物提取多肤的方法，尤其设及一种鱼饌胶原蛋白多功能 肤的制备方法。
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【背景技术】
[0003] 自由基是机体许多生化反应的中间产物，正常情况下，其产生和清除处于平衡状 态。但是，当运一平衡被打破时，自由基会使机体处于氧化压力之下，通过攻击生命大分子 物质及各种细胞器，造成机体在分子、细胞及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老、 疲劳并诱发各种疾病。
[0004] 根据自由基理论，人体疲劳的产生和体内自由基生成相关，因而具有抗氧化活性 的物质存在潜在的抗疲劳活性。
[0005] 天然的生物活性物质相对于市售的合成剂，具有健康安全的优势，因此，开发海洋 生物活性物质具有重要意义。
[0006] 胶原蛋白主要存在于动物的骨、腫、软骨和皮肤等结缔组织中，是结缔组织中胶原 蛋白纤维的蛋白质。胶原蛋白在发展历史过程中，其重要的材料来源一直是陆生动物猪和 牛，因为它们具有来源丰富的皮和骨。虽然，人们早已了解了鱼胶原蛋白，但遗憾的是，未能 将其作为工业上应用的重要材料，运主要是由于水产捕拱来源不稳定，缺乏规模。近年来， 环境等诸多因素引发了陆生动物疾病的产生，如疯牛病等，陆生动物蛋白质的安全性受到 质疑；而水产养殖和水产品加工业有了很大的发展，鱼皮、鱼鱗、鱼骨和鱼内脏等鱼类加工 下脚料的来源日趋稳定，且具有安全性。因而，对鱼类胶原蛋白的应用与开发已经成为人们 关注的热点。然而，胶原蛋白独特的=螺旋结构是非常稳定的，加热时间短和加热溫度一般 时都难W使其分解，因而不容易被消化吸收。而胶原蛋白水解而得的胶原蛋白肤却能弥补 运一缺陷，其分子量小，易于身体吸收。国内外的研究已经表明，水产胶原蛋白肤具有多种 功能，包括抗氧化、抗疲劳、抑制血管紧张素转化酶、提高免疫力、抗衰老和抗肿瘤等，并且 W其具有的高度生物安全性，可广泛应用于食品、化妆品及医药制备等领域，开发前景非常 广阔。
[0007] 鱼饌作为渔业加工下脚料，常被废弃或作为简单的加工材料而得不到充分的利 用。目前，对于鱼饌蛋白肤的制备及其活性的相关研究甚少，因此，W养殖大黄鱼鱼饌为原 料制备多肤并研究其抗氧化与抗疲劳活性，为海洋药物和保健食品开发提供理论和实验依 据。
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【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效 的鱼饌胶原蛋白多功能肤的制备方法。
[0010] 本发明为解决上述问题所采取的技术方案为：一种鱼饌胶原蛋白多功能肤的制备 方法，其包括W下步骤： 1)清洗步骤：选取鱼饌用流动水彻底清洗，剪成小块儿（0. 5X0. 5cm。用0. 1M化OH W1:10 (w/v)，每4h更换一次溶剂，然后用冷蒸馈水洗至中性，可除去非胶原蛋白等杂蛋 白；为了脱脂，接着用10%正下醇Wl:l〇 (w/v)的比例浸泡12h，每3h更换一次溶剂，然 后用10倍体积的冷蒸馈水冲洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更换一次溶剂， 最后用冷蒸馈水冲洗。将预处理好的鱼饌进行匀浆，备用。
[0011] 2)酶解步骤：W包含动物、植物及微生物蛋白酶在内的4种商业化蛋白酶(木瓜 酶、膜蛋白酶、胃蛋白酶及碱性蛋白酶)，分别在其最适条件下酶解匀浆后的鱼饌，酶解时间 均为6h，加酶量均为鱼饌匀浆质量的2%，料液比为1:3 ; 3)纯化步骤：上述步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后，通过Se地adexG-25层析 柱（2.6cmX60cm)进一步分离纯化，样品浓度为25111旨/111以上样量为2血，用去离子水洗脱， 洗脱速度为1. 5mL/min，于紫外分光光度计280nm下检测，收集各洗脱峰，浓缩后冷冻干燥， 检测各洗脱组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩，冷冻干燥，W0. 1%TFA去 离子水配制Img/mL样品溶液，过0. 22ym微孔滤膜，利用RP-HPLC进一步分离纯化，色谱 分析条件为：进样量，20yL;色谱柱类型，C18HypersilBDS(250mmX4.6mm，5帕）；柱 溫，30°C;流动相为乙腊-水溶液（含有0. 1血/100血的S氣乙酸），采用梯度洗脱，在 SOmin洗脱时间内乙腊浓度由0%线性递增至100% ;洗脱流速，1.OmL/min;紫外检测波长设 定280nm。同样收集各洗脱峰后，浓缩并冷冻干燥，经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作 为目标肤氨基酸序列为：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His(GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH)。本发 明具有操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的优点。
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【附图说明】
[0013] 图1是本发明的蛋白肤分子量测定质谱图； 图2是本发明的蛋白肤高效液相色谱C18柱洗脱峰整体洗脱图； 图3是本发明的蛋白肤高效液相色谱C18柱洗脱峰局部洗脱图。
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【具体实施方式】
[0015] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016] 实施例：养殖大黄鱼鱼饌为原料制备多肤并研究其抗氧化与抗疲劳活性，为海洋 药物和保健食品开发提供理论和实验依据。鱼饌胶原蛋白多功能肤的制备方法，其包括W 下步骤： 1)清洗步骤：选取鱼饌用流动水彻底清洗，剪成小块儿（0. 5X0. 5cm。用0. 1M化OH W1:10 (w/v)，每4h更换一次溶剂，然后用冷蒸馈水洗至中性，可除去非胶原蛋白等杂蛋 白；为了脱脂，接着用10%正下醇Wl:l〇 (w/v)的比例浸泡12h，每3h更换一次溶剂，然 后用10倍体积的冷蒸馈水冲洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更换一次溶剂， 最后用冷蒸馈水冲洗。将预处理好的鱼饌进行匀浆，备用。
[0017] 2)酶解步骤：W包含动物、植物及微生物蛋白酶在内的4种商业化蛋白酶(木瓜 酶、膜蛋白酶、胃蛋白酶及碱性蛋白酶)，分别在其最适条件下酶解匀浆后的鱼饌，酶解时间 均为6h，加酶量均为鱼饌匀浆质量的2%，料液比为1:3 ; 3)纯化步骤：上述步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后，通过Se地adexG-25层析 柱（2.6cmX60cm)进一步分离纯化，样品浓度为25111旨/111以上样量为2血，用去离子水洗脱， 洗脱速度为1. 5mL/min，于紫外分光光度计280nm下检测，收集各洗脱峰，浓缩后冷冻干燥， 检测各洗脱组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩，冷冻干燥，W0. 1%TFA去 离子水配制Img/mL样品溶液，过0. 22ym微孔滤膜，利用RP-HPLC进一步分离纯化，色谱 分析条件为：进样量，20yL;色谱柱类型，C18HypersilBDS(250mmX4.6mm，5帕）；柱 溫，30°C;流动相为乙腊-水溶液（含有0. 1血/100血的S氣乙酸），采用梯度洗脱，在 SOmin洗脱时间内乙腊浓度由0%线性递增至100% ;洗脱流速，1.OmL/min;紫外检测波长设 定280nm。同样收集各洗脱峰后，浓缩并冷冻干燥，经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作 为目标肤氨基酸序列为：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pr