o-Asn-His(GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH)。本发 明具有操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的优点。
[0018] 本发明为解决上述第=个技术问题所采取的技术方案为：一种鱼饌胶原蛋白肤的 用途，该蛋白肤的氨基酸序列为： Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-T yr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His(GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH)，其分子量为 6719. 5718Da， 具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抗氧化保健食品或添加剂、也可用于制 备抗疲劳保健食品或添加剂。
[0019] 自由基是机体许多重要的生化反应的中间代谢产物，正常状况下，其产生和清除 处于动态平衡。然而，自由基是有效的防御系统，如果机体不能维持运一动态平衡，则会 使自己处于氧化压力状态下，自由基通过攻击机体大分子物质和细胞器，对机体造成损伤。 然而，肌肉细胞含有复杂的内源性细胞防御机制W清除氧自由基巧日谷脫甘肤过氧化物酶 (GSH-Px)、超氧化物歧化酶（SOD)、过氧化氨酶（CAT)等)，对机体由运动引发的氧化损伤和 DNA损伤具有一定的保护作用。GSH-Px可加速&〇2和G甜的反应，并将它们转化为水和氧 化性谷脫甘肤；SOD可W清除超氧阴离子自由基；CAT可W降解径自由基。
[0020] 表1本发明蛋白肤（SBP-III-3)对小鼠负重游泳时间的影响
注：与对照组比较冲<0. 05, *冲<0.Ol;与低剂量组比较平<0. 05,中<0.Ol评价剧烈运动能力的又一重要指标是能量W糖原形式储存的能力。运动所需能量首先 来源于糖原的分解，然后来自肌肉和肝脏中的糖原流通。
[0021] 表2本发明蛋白肤（SBP-III-3)对小鼠抗氧化酶活力的影响
注：与对照组相比*尸< 0. 05，**K0.Ol;与低剂量组相比a尸< 0. 05，V< 0.Oi 运动中，当肌糖原减少时，肝糖原含量的降低则成为运动耐力的主要限制因素。因此， 增加肝糖原和肌糖原储备有利于增强耐力和运动能力。各剂量组小鼠的肝糖原水平明显 高于对照组，并且高剂量组显著高于低剂量组（P<〇.〇5或P< 0.01)。剂量组SBP-ffi；和 SBP-MG小鼠的肌糖原水平明显高于对照组（P< 0.01)。此结果表明，纯化肤可通过维持体 内糖原含量为机体储备能量而达到抗疲劳的效果。
[0022] 实验通过测定S0D、GSH-Px和CAT的活性W评价纯化肤SBP-III-3的抗氧化活性。 结果如表2所示与对照组相比，剂量组SBP-服和SBP-MG小鼠体内的T-SOD活性分别增加 了 44. 2%和15. 7%，具有差异显著性，然而低剂量组SBP-LG则增加了 4. 2%，与对照组并无显 著性差异（P< 0.05)。另外，剂量组SBP-HG和SBP-MG之间也有显著差异性（P< 0.01)。 GSH-Px和CAT的活性与T-SOD具有相同趋势。丙二醒（MDA)是一种脂质过氧化物，可W反 映机体自由基的含量。本实验还检测了小鼠肝脏和血浆中的MDA含量。结果如表3所示， =个剂量组小鼠的MDA水平均低于对照组水平，且高、中剂量组小鼠的肝脏中MDA含量均显 著高于对照组（P< 0.05或P< 0.01)。W上研究结果表明，该纯化肤可能通过控制自由 基的积累W保护机体不受氧化损伤，从而具有抗疲劳的效果。
[002引表3本发明蛋白肤（SBP-III-3)对小鼠血浆和肝脏中MDA含量的影响
注：与对照组相比*/^ < 0. 05，**K0.Ol;与低剂量组SBP-LG相比节< 0. 05，V< 0.Ol 尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用W限定本发明，任何本领域技术 人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在运里列出的主题实施各种改变、同 等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 清洗步骤：选取鱼鳔用流动水彻底清洗，剪成小块儿（〇. 5X0. 5cm;用0.IMNaOH 以1:10 (w/v)，每4h更换一次溶剂，然后用冷蒸馏水洗至中性，可除去非胶原蛋白等杂蛋 白；为了脱脂，接着用10%正丁醇以1:10的重量体积比浸泡12h，每3h更换一次溶剂，然 后用10倍体积的冷蒸馏水冲洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更换一次溶剂， 最后用冷蒸馏水冲洗；将预处理好的鱼鳔进行匀浆，备用； 2) 酶解步骤：以蛋白酶酶解匀浆后的鱼鳔，酶解时间均为6h，加酶量均为鱼鳔匀浆质 量的2%，料液比为1:3 ; 3) 纯化步骤：上述酶解步骤处理得到的组分浓缩、冷冻干燥后，通过S印hadexG-25 层析柱进一步分离纯化，样品浓度为25mg/mL，上样量为2mL，用去离子水洗脱，洗脱速度为 I. 5mL/min，于紫外分光光度计280nm下检测，收集各洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，检测各洗脱 组分的抗氧化活并收集活性较高的洗脱峰进行浓缩，冷冻干燥，以0. 1%TFA去离子水配制 lmg/mL样品溶液，过0. 22ym微孔滤膜，利用RP-HPLC进一步分离纯化；收集各洗脱峰后， 浓缩并冷冻干燥，经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列为： Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-T yr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-Hi s 〇2. 根据权利要求1所述的一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于所述的 蛋白酶为木瓜酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或碱性蛋白酶。3. 根据权利要求1所述的一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于所述的 Sephadex G-25 层析柱的规格为 2. 6cmX60cm。4. 根据权利要求1所述的一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其特征在于所述的 RP-HPLC的色谱分析条件为：进样量，20yL;色谱柱类型是规格为250mmX4. 6mm，5Mm的 C18HypersilBDS;柱温，30°C;流动相为含有0.1mL/100mL的三氟乙酸的乙腈-水溶 液；采用梯度洗脱，在50min洗脱时间内乙腈浓度由0%线性递增至100% ;洗脱流速，I.OmL/ min;紫外检测波长设定280nm。
【专利摘要】本发明涉及一种鱼鳔胶原蛋白多功能肽的制备方法，其包括清洗、酶解、纯化等步骤经活性筛选出抗氧化活性最强的组分作为目标肽氨基酸序列为：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His。本发明具有操作方便、最终产品纯度高、具有抗氧化抗疲劳功效的优点。
【IPC分类】C12P21/06, C07K1/20
【公开号】CN105219827
【申请号】CN201510759068
【发明人】杨最素, 曾丽, 丁国芳, 徐银峰, 张亚茹, 吴宗泽
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月10日