鼠疫菌素和噬菌体溶菌酶融合蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及一种重组融合蛋白及其用途，特别涉及一种由鼠 疫菌素蛋白Pst和噬菌体溶菌酶e形成的融合蛋白及其编码的基因，以及该融合蛋白在抗 金黄色葡萄球菌中的应用。
【背景技术】
[0002] 噬菌体是一类能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，作为抗 生素的替代品，具有潜在的开发价值。噬菌体主要通过溶菌酶作用于细菌细胞壁中的肽聚 糖成分，引起细菌裂解。溶菌酶产生于噬菌体溶菌周期中的生物合成晚期，可以高度纯化， 在杀伤细菌时具有作用时间短、不易失活、不受细菌耐药性限制、对人和动物无副作用等优 点，并且溶菌酶的裂解谱一般比其来源的噬菌体裂解范围更广。由于细菌细胞壁的结构差 异，溶菌酶对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的杀伤效果不同。革兰氏阳性菌细胞壁主要由 肽聚糖组成，低浓度的溶菌酶即可发挥明显的杀菌效应，但是革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚 糖层外面还有一层外膜包裹，溶菌酶不能从外部对其产生破坏作用。
[0003] 鼠疫菌素是鼠疫耶尔森菌产生的一种细菌素，鼠疫菌素能够裂解某些致病性大肠 杆菌，但对动物细胞没有毒性。鼠疫菌素序列N端1-164位为跨膜域与受体结合域，能够结 合大肠杆菌细胞壁的外膜蛋白FyuA，触发细胞膜上的能量系统，随后鼠疫菌素被转运进周 质间隙。鼠疫菌素C端168-357位为活性结合域，能够断裂肽聚糖链上的β-1，4糖苷键，降 解肽聚糖，引起细菌裂解。但是由于鼠疫菌素作为一种细菌素，其作用较弱，未见临床应用 的报道。
[0004] 鼠疫菌素C端活性结合域能够降解细菌细胞壁的肽聚糖，从而导致细菌裂解，这 与噬菌体溶菌酶的功能相似，分析发现两者序列相似性只有13%，但其空间结构却极为相 似，表明其作用方式具有相似性。因此理论上以溶菌酶序列替代鼠疫菌素C端活性结合域 序列形成的融合蛋白，能够具备溶菌酶裂解革兰氏阳性菌的高活性，同时利用融合蛋白Ν 端的跨膜域与受体结合域穿过大肠杆菌外膜，从而裂解大肠杆菌。目前针对该种融合蛋白 的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的使提供一种鼠疫菌素和噬菌体溶菌酶融合蛋白及其编码基因与应 用。
[0006] 本发明提供的融合蛋白自氨基端到羧基端依次含有鼠疫杆菌的鼠疫菌素蛋白Pst 和噬菌体Bp7的溶菌酶e。
[0007] 所述鼠疫菌素蛋白Pst的氨基酸序列为序列表中序列1的第1-167位；所述溶菌 酶e的氨基酸序列为序列表中序列1的第168-330位。
[0008] 所述的融合蛋白具体为如下（1)或（2): (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白； (2)将序列1中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加 且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白。
[0009] 其中，序列1由330个氨基酸组成，第1-167位为所述鼠疫菌素蛋白Pst，第 168-330位为所述溶菌酶e。
[0010] 所述的融合蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。
[0011] 所述融合蛋白的编码基因具体为下述（1)- (3)中任一所述基因： (1) 序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 与（1)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码所述融合蛋白的DNA分子； (3 )在严格条件下与（1)或（2 )限定的DNA分子杂交，且编码所述融合蛋白的DNA分子。
[0012] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C条件下杂交，然后用 2XSSC，0. 1%SDS和 1XSSC，0. 1%SDS各洗膜一次。
[0013] 其中，序列2由990个核苷酸组成，编码序列1中所示融合蛋白。
[0014] 含有所述基因的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0015] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0016] 在本发明的实施例中，所述重组表达载体为在Pet28a载体的多克隆位点处插入 所述基因后得到的重组质粒（pET28a-Pst-E)。所述多克隆位点具体为EcoRI和XhoI。
[0017] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组 成。
[0018] 所述重组菌为将所述的重组表达载体倒入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选 为大肠杆菌，所述大肠杆菌优选为BL21。
[0019] 所述融合蛋白，或所述基因，或所述重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌用 于制备预防或/和治疗禽源大肠杆菌病的生物制品也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明的另一个目的使提供一种预防或/和治疗金黄色葡萄球菌病的生物制品。
[0021] 本发明所提供的预防或/和治疗金黄色葡萄球菌病的生物制品，其活性成分为所 述融合蛋白，所述基因，所述重组表达载体、表达盒、重组细胞或所述重组菌。
[0022] 序列 1: MSDTMVVNGSGGVPAFLFSGSTLSSYRPNFEANSITIALPHYVDLPGRSNFKLMYIMGFPIDTEMEKDSEYSN KIRQESKISKTEGTVSYEQKITVETGQEKDGVKVYRVMVLEGTIAESIEHLDKKENEDILNNNRNRIVLADNTVINF DNISQLKEFLRRSVNIVMDIFDMLRQGEGLDLNLYKDTEGYWTIGIGQLVTKNPSKDVARAELDKLMGRVCNGRITM AEAEQLFNRSVENARRAILRNPKLKPVYDVLDEVRRCALINMVFQMGEAGVAGFTNSLRMLQQKRWNDAAVNLAQSR WYKQTPNRAKRVIATFKTGTWAAYR. 序列2 : ATGTCAGATACAATGGTAGTGAATGGTTCAGGTGGTGTTCCGGCTTTTCTCTTTTCCGGAAGTACATTAAGCA GTTACAGACCAAATTTTGAAGCTAATTCGATTACAATTGCATTACCACATTATGTGGATCTGCCTGGCCGGAGTAAT TTTAAACTGATGTACATTATGGGGTTTCCGATTGATACGGAGATGGAGAAAGACAGTGAATATTCAAATAAGATCCG CCAGGAAAGTAAAATTTCAAAAACTGAAGGGACCGTGTCTTACGAACAGAAAATAACTGTTGAAACAGGTCAGGAAA AAGACGGTGTGAAAGTCTACCGTGTCATGGTTCTTGAGGGAACGATTGCCGAATCTATTGAACATCTCGATAAGAAA GAGAACGAAGACATTCTGAATAATAACCGAAATCGCATCGTCCTAGCGGACAACACTGTCATTAACTTTGACAATAT TAGTCAACTGAAGGAATTTTTACGTCGTTCGGTAAATATTGTTATGGATATTTTTGATATGTTACGTCAAGGCGAAG GTCTTGATTTAAATCTTTATAAAGACACTGAAGGTTATTGGACTATTGGTATTGGCCAGTTAGTTACCAAGAACCCA TCTAAAGATGTTGCTCGTGCTGAACTTGATAAGCTTATGGGTCGAGTTTGCAATGGTCGTATTACTATGGCTGAAGC CGAACAACTCTTTAACCGGTCGGTTGAAAATGCTCGTAGAGCTATTCTGCGTAATCCTAAATTGAAACCTGTTTATG ATGTACTGGACGAAGTTCGTCGTTGTGCTTTAATTAACATGGTCTTCCAAATGGGTGAAGCAGGTGTAGCAGGGTTC ACTAACTCTTTACGTATGCTCCAACAGAAACGTTGGAATGATGCGGCAGTTAACCTGGCCCAATCCCGTTGGTATAA ACAAACTCCTAATCGTGCTAAGCGCGTTATCGCCACCTTTAAAACAGGTACTTGGGCTGCTTATAGATAA 本发明首次将鼠疫杆菌的鼠疫菌素基因Pst和噬菌体Bp7的溶菌酶基因e串联起来， 构建了重组表达重组质粒pET28a-Pst-E，并在大肠杆菌中表达获得了融合蛋白Pst-E。与 鼠疫菌素Pst相比，具有更高的细菌裂解活性。试验证明，鼠疫菌素Pst与菌液相互作用后， 金黄色葡萄球菌细菌数下降22%，大肠杆菌078细菌数下降14%。融合蛋白Pst-E与菌液相 互作用后，金黄色葡萄球菌细菌数下降44%，大肠杆菌078细菌数下降2. 7%。本发明为开发 抗金黄色葡萄球菌的生物制品提供理论和实践依据。
【附图说明】
[0023] 图1为鼠疫菌素基因Pst、噬菌体Bp7的溶菌酶基因e以及两者串联基因Pst-e 的PCR产物。其中，泳道Μ为DNA分子量标准DL2000Marker;泳道1为Pst基因的PCR 产物（501bp);泳道2为e基因的PCR产物（489bp);泳道1为Pst-e串联基因的PCR产物 (990bp)〇
[0024] 图2为重组质粒pET28a-Pst-E的双酶切鉴定结果。其中，泳道Μ为DNA分子量标 准DL2000Marker;泳道1为重组质粒pET28a-Pst-E的EcoRI和XhoI的双酶切结果。
[0025] 图3融合蛋白Pst-ESDS-PAGE及western-blot检测结果。其中，泳道1为融合 蛋白Pst-E在表达菌BL21沉淀中的表达情况；泳道2为融合蛋白Pst-E在