表达菌BL21上 清中的表达情况；泳道Μ为标准蛋白分子量Marker;泳道3为携带空载体pET28a的表达菌 BL21的蛋白表达情况；泳道4为纯化后的融合蛋白Pst-E的含量；泳道5为融合蛋白Pst-E 的western-blot检测结果。
[0026] 图4融合蛋白Pst-E的抑菌活性检测结果。其中图4A为融合蛋白Pst-E对金黄 色葡萄球菌25923的抑菌作用；图4B为融合蛋白Pst-E对078型大肠杆菌的抑菌作用。图 中箭头所示为融合蛋白Pst-E形成的抑菌圈；Pst和卡那霉素分别为蛋白对照和药物对照。
[0027] 图5融合蛋白Pst-E的溶菌活性测定结果。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 携带鼠疫菌素基因的质粒，公众可从山东省青岛农业大学动物科技学院微生物与 免疫实验室获得。
[0031] 携带噬菌体溶菌酶基因的质粒，公众可从山东省青岛农业大学动物科技学院微生 物与免疫实验室获得。
[0032] 下述实施例中的所有引物均由上海生工合成；测序工作均由华大基因科技有限公 司完成。
[0033] 实施例1.重组表达质粒pET28a-Pst-E的构建及表达 1. 引物的设计与合成 根据鼠疫菌素基因（Pst)和噬菌体溶菌酶基因（e)的序列，设计并合成引物(表1)。其 中引物FI、F2用于扩增Pst基因的0RF，引物F3、F4用于扩增e基因的ORF，FI、F4引物序 列中分别携带EcoRI和XhoI酶切位点（下划线部分)。
[0034] 表1鼠疫菌素基因（Pst)和噬菌体溶菌酶基因（e)的引物序列
2. 目的基因的扩增 分别以携带鼠疫菌素基因的质粒Pst-T和携带噬菌体溶菌酶基因的质粒e-T为模板， 采用步骤1中设计的引物对F1/F2和F3/F4进行PCR反应，分别扩增鼠疫菌素基因Pst和 噬菌体溶菌酶基因e。反应条件为94°C预变性5min，然后开始循环：94°C变性30s，52°C退 火3〇8,72°(：延伸4〇8,30个循环，最后72°(：总延伸5 1^11。1.0%琼脂糖凝胶电泳检查？0? 产物，结果如图1所示，得到大小约为500bp的两个条带，与预期结果相符。将扩增得到的 PCR产物分别用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化回收，经测序证实分别为鼠疫菌素基 因和噬菌体Bp7的溶菌酶基因，将这两个PCR产物分别命名为Pst和e。
[0035] 将扩增得到的PCR产物Pst和e分别用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化，以 纯化后的Pst和e产物为模板，以F1/F4为上下游引物进行第二轮PCR反应，扩增Pst和e 基因的串联片段Pst-E。反应条件为94°C预变性5min，然后开始循环：94°C变性1min，52°C 退火1min，72°C延伸1min，30个循环，最后72°C总延伸10min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检 查PCR产物，结果如图1所示，得到大小约为990bp的目的条带，与预期结果相符。将扩增 得到的PCR产物用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行纯化获得纯化的目的片段，经测序证实 为鼠疫菌素基因和噬菌体Bp7的溶菌酶基因的串联片段，将该PCR产物命名为Pst-E。
[0036] 3.重组表达质粒pET28a-Pst_E的构建 用限制性内切酶EcoRI和XhoI对表达载体pET28a和纯化的PCR产物Pst-E进行双 酶切，经琼脂糖凝胶电泳验证后回收得到线性具有粘性末端的载体片段和目的片段。用T4 DNA连接酶将目的片段与载体pET28a进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细 胞，筛选阳性克隆，提质粒，进行双酶切鉴定，测序。双酶切结果如图2所示，Pst-E片段正 确插入pET28a的EcoRI和XhoI识别位点间；测序结果与预期结果一致，将该重组表达质 粒命名为pET28a-Pst-E。
[0037] 重组表达质粒pET28a-Pst_E的结构描述为：在pET28a载体的多克隆位点EcoRI 和Xho I之间插入序列表中序列2片段后得到的重组质粒。
[0038] 序列2共由990个核苷酸组成，其中1-501位为所述鼠疫菌素Pst基因，502-990 位为所述噬菌体溶菌酶e基因。
[0039] 序列2编码序列表中序列1所示的蛋白。序列1共由330个氨基酸组成，第1-167 位为所述鼠疫菌素Pst蛋白，第168-330位为所述噬菌体溶菌酶e蛋白。
[0040]序列1: MSDTMVVNGSGGVPAFLFSGSTLSSYRPNFEANSITIALPHYVDLPGRSNFKLMYIMGFPIDTEMEKDSEYSN KIRQESKISKTEGTVSYEQKITVETGQEKDGVKVYRVMVLEGTIAESIEHLDKKENEDILNNNRNRIVLADNTVINF DNISQLKEFLRRSVNIVMDIFDMLRQGEGLDLNLYKDTEGYWTIGIGQLVTKNPSKDVARAELDKLMGRVCNGRITM AEAEQLFNRSVENARRAILRNPKLKPVYDVLDEVRRCALINMVFQMGEAGVAGFTNSLRMLQQKRWNDAAVNLAQSR WYKQTPNRAKRVIATFKTGTWAAYR. 序列2 : ATGTCAGATACAATGGTAGTGAATGGTTCAGGTGGTGTTCCGGCTTTTCTCTTTTCCGGAAGTACATTAAGCA GTTACAGACCAAATTTTGAAGCTAATTCGATTACAATTGCATTACCACATTATGTGGATCTGCCTGGCCGGAGTAAT TTTAAACTGATGTACATTATGGGGTTTCCGATTGATACGGAGATGGAGAAAGACAGTGAATATTCAAATAAGATCCG CCAGGAAAGTAAAATTTCAAAAACTGAAGGGACCGTGTCTTACGAACAGAAAATAACTGTTGAAACAGGTCAGGAAA AAGACGGTGTGAAAGTCTACCGTGTCATGGTTCTTGAGGGAACGATTGCCGAATCTATTGAACATCTCGATAAGAAA GAGAACGAAGACATTCTGAATAATAACCGAAATCGCATCGTCCTAGCGGACAACACTGTCATTAACTTTGACAATAT TAGTCAACTGAAGGAATTTTTACGTCGTTCGGTAAATATTGTTATGGATATTTTTGATATGTTACGTCAAGGCGAAG GTCTTGATTTAAATCTTTATAAAGACACTGAAGGTTATTGGACTATTGGTATTGGCCAGTTAGTTACCAAGAACCCA TCTAAAGATGTTGCTCGTGCTGAACTTGATAAGCTTATGGGTCGAGTTTGCAATGGTCGTATTACTATGGCTGAAGC CGAACAACTCTTTAACCGGTCGGTTGAAAATGCTCGTAGAGCTATTCTGCGTAATCCTAAATTGAAACCTGTTTATG ATGTACTGGACGAAGTTCGTCGTTGTGCTTTAATTAACATGGTCTTCCAAATGGGTGAAGCAGGTGTAGCAGGGTTC ACTAACTCTTTACGTATGCTCCAACAGAAACGTTGGAATGATGCGGCAGTTAACCTGGCCCAATCCCGTTGGTATAA ACAAACTCCTAATCGTGCTAAGCGCGTTATCGCCACCTTTAAAACAGGTACTTGGGCTGCTTATAGATAA 4.重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化 (1)重组蛋白的表达 将重组质粒用热激法转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，37°C条件下于含Kana的LB平 板上倒置培养过夜。随机挑取单个菌落，接种含Kana的LB液体培养基，37°C振荡培养约2h 使培养液的0D600约为0. 6-0. 8,加入终浓度为0. 8mmol/LIPTG诱导蛋白表达，37°C振荡培 养5h后离心收集菌体，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况，同时设相同条件下诱导表 达的携带pET28a空质粒的BL21为对照。电泳检测结果如图3所示，融合蛋白Pst-E主要 以包涵体形式在表达菌BL21中正确表达；对照菌体为阴性，证明没有融合蛋白表达。
[0041] (2)重组蛋白的鉴定 以步骤（1)获得融合蛋白Pst-E进行SDS-PAGE电泳，随后进行western-blot检测。western-blot检测使所用的一抗为鼠抗HIS标签的单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔 IgG抗体。western-blot检测结果如图3所示，融合蛋白Pst-E得到正确表达。
[0042] (3)重组蛋白的纯化 将步骤（1)获得的IPTG诱导后的菌液离心收集菌体，用50mL裂解缓冲液(成分为1mol/L、pH值为 8. 0的Tris-HCL缓冲液，5mol/LNaCl，0. 5mol/LEDTA，5 % 甘油）重悬菌 体，30°C水浴作用lOmin，冰浴间歇超声破碎，条件为：超声3s、间歇Is、共30min，待菌液较 清亮时停止超声，12000r/min离心10min得到菌体破碎物沉淀，此沉淀即为包涵体粗提取 物。在包涵体粗提取物中加入9倍体积的包涵体洗涤液I(成分为50mmol/LpH值为8.0 的Tris-HCl缓冲液，lOOmmol/LNaCl，2mmol/LEDTA，0.5%TritionX-100)重悬沉淀， 轻轻混匀后常温作用15