一种生产猪源脂联素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药领域，具体讲提供了一种生产猪源脂联素的方法。
【背景技术】 W02] 脂肪组织（adiposetissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联 素（Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质。脂联素是 一种膜岛素增敏激素（AnInsulin-sensitizingHormone)，能改善小鼠的膜岛素抗性 (Insulinresistance)和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病 和冠屯、病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。
[0003] 在脂肪细胞分泌的具有生物活性的一类蛋白质因子中，脂联素是脂肪组织基因表 达最丰富的蛋白质产物之一，大量存在于血液循环中。在人体内W3-30ug/ml的浓度出现 在循环血浆中。脂联素又被称作Ac巧30、apMl、AdipoQ、GBP28。最初，脂联素是在人体皮 下脂肪组织、血浆和鼠科动物的脂肪细胞中被发现。人体内的脂联素由244个氨基酸组成， 分子量为30邸，由氨基末端的分泌信号序列（aa1-18)，一段特异序列（aal9-41)，一组由 22个氨基酸组成的胶原重复序列（aa42-107)，一段球状序列（aal08-244)组成。其中球 状区是脂联素生物活性的关键部位，和TNF-α的结构相似，脂联素与胶原W、X和补体Clq 高度同源。脂联素的单聚体和Ξ聚体是其生物活性形式或受体亲和配基可W特异性结合骨 骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白截联受体一型或二型脂联素受体，进而调节脂肪酸氧化和糖 代谢。
[0004] 目前关于用基因工程的方法来表达生产脂联素的报道还比较少。枯草芽抱杆菌具 有良好的分泌特性，其发酵工艺和产物回收技术也比较成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主 菌，具有很大潜力。相关研究表明，多种外源蛋白都能在枯草芽抱杆菌中分泌表达，有些还 获得了较高的产率。枯草芽抱杆菌WB700菌株是缺失7种胞外蛋白酶的枯草芽抱杆菌突变 株，其保外残余的蛋白酶活性只相当于野生菌株的0. 1 %，是一种表达外源蛋白的理想宿主 困株。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种生产猪源脂联素方法，W克服当前脂联素在产业化应 用中产量不足的问题。目前还没有用枯草芽抱杆菌WB700表达系统生物合成猪源脂联素的 报道。枯草芽抱杆菌是一种原核单细胞微生物，具有培养条件易于控制、增殖速度迅速、表 达量高和表达产物易于分离纯化等特点。
[0006] 本发明所提供的生产猪源脂联素的方法包括W下步骤：
[0007] 1.可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与 猪源脂联素融合蛋白的操纵子的合成：
[0008] a)人工合成含枯草芽抱杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽抱杆 菌果聚糖薦糖酶信号肤sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段 Pglv-sacB-ulpl(可W是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成），其核巧酸序列为：
[0010] b)人工合成枯草芽抱杆菌高效启动子P43、编码枯草芽抱杆菌果聚糖薦糖酶信号 肤sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的 融合DNA片段P43-sacB-sumol-adipo(可W是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成），其 核巧酸序列为：
[0012] 2.猪源脂联素母体基因可在枯草芽抱杆菌表达的载体pZLS-128的构建：
[0013] 将所述步骤a)中人工合成的基因片段Pglv-sacB-ulpl用BamHI和SacI双酶切， 将所述步骤b)中人工合成的基因片段P43-sacB-sumol-adipo用BamHI和Bglll双酶切， 依次构建入载体PGJ222,构建成命名为pZLS-128的质粒。
[0014] 3.重组表达载体pZLS-128在枯草芽抱杆菌WB700中的转化：
[0015] 优选地，将枯草芽抱杆菌WB700感受态细胞与质粒pZLS-128混合并将混合物转移 至2mm电转杯，在2. 5kV、5mV条件下电击；之后立即加入1000μ1预冷的枯草芽抱杆菌电转 恢复培养基Μ，于37°C、22虹pm条件下恢复培养比；500化pm离屯、后将管底菌体均匀涂布 于含有Cm5的LB固体平皿上，培养皿放置于37Γ培养至单菌落出现；挑取单菌落置于LB液 体培养基振荡培养被提取质粒进行EcoRI和SacI双酶切鉴定和测序鉴定；将鉴定正确的单 菌落定义为BZLS128。
[0016] 4.重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达：
[0017] 优选地，将筛选得到重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的 LB液体培养基中，于30°C、225巧m的条件下振荡培养8~1化至595皿波长处的吸光值 (0D595)达到2~4,之后加入5ml质量百分比浓度为30%的麦芽糖溶液进行诱导表达；接 着于25°C、225巧m的条件下再继续振荡培养36~4她，1200化pm离屯、10分钟收集培养液 上清，即为获得的猪源脂联素蛋白。
[0018] 本发明人工设计合成包含有小分子泛素样修饰物（smallubiquitin-related modifier,SUMO)蛋白酶W及猪源脂联素蛋白与SUMO融合的双顺反子表达元件基因，W质 粒pZLS-128为大肠杆菌一枯草芽抱杆菌穿梭载体，构建了一个猪源脂联素的重组枯草芽 抱杆菌WB700的表达系统。该系统具有优良的质粒稳定性，W及分泌表达的SUMO-脂联素 蛋白偶合物能有效地被同样分泌表达的SUMO蛋白酶水解从而释放出具有正常生物学活性 的脂联素。SUMO融合表达体系为枯草芽抱杆菌WB700菌株能够分泌具有正常生物学活性所 对应的猪源脂联素的构象提供了材料基础。
[0019] 该系统解决了当前脂联素产业化所面临的一些关键问题：天然提取的脂联素成本 太高，产业化困难：脂联素分子量不大，在其它微生物表达体系下容易被降解或难W形成正 常生物学活性所对应的构象：分离纯化工艺复杂等。
[0020] 本发明的有値结果为：
[0021] 1.表达系统简单：本发明采用了猪源抗菌肤的重组枯草芽抱杆菌WB700表达体系 与SUMO融合表达体系，由于融合表达后得到的SUMO-脂联素融合蛋白体不会对宿主菌枯 草芽抱杆菌WB700菌株产生毒害作用，因此可W使重组枯草芽抱杆菌WB700菌株持续表达 产物，而其生长则不会得到抑制。
[0022] 2.本发明可用于大规模生产：本发明采用枯草芽抱杆菌WB700表达体系，相对于 真核细胞表达系统和病毒表达系统具有生产条件和步骤简单，反应条件易于控制的优点， 因此适用于大规模的的生产。
[0023] 3.生产成本低：本生产方法中的培养基价格低廉，生产所用设备为实验室常规设 备，易于操作。
[0024] 4.生物活性强，无毒害物质：本发明分泌的蛋白质浓度高，生物活性强。
【附图说明】： 阳ο巧]图1为猪源脂联素的Tris-SDS-PAGE分析 阳026] 其中，横坐标表示的是蛋白电泳的泳道序号，纵坐标表示的是蛋白marker的分子 量大小：
[0027] 1 :蛋白marker:分子量（116. 0kDa、66. 2kDa、45. 0kDa、35.OkDa和 25.OkDa);
[0028] 2 :对照组：枯草芽抱杆菌WB700上清冻干样品；
[0029] 3 :实验组：重组枯草芽抱杆菌BZLS128上清冻干样品。
【具体实施方式】 阳〇3〇]实施例1
[0031] 1.可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与 猪源脂联素融合蛋白的操纵子的合成： W巧 a)人工合成含枯草芽抱杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽抱杆 菌果聚糖薦糖酶信号肤sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulpl(可W是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成），其核巧酸序列为：
[0034]b)人工合成枯草芽抱杆菌高效启动子P43、编码枯草芽抱杆菌果聚糖薦糖酶信号 肤sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的 融合DNA片段P43-sacB-sumol-adipo(可W是由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成），其 核巧酸序列为：
[0036] 2.猪源脂联素母体基因可在枯草芽抱杆菌表达的载体pZLS-128的构建：
[0037] 将所述步骤a)中人工合成的基因片段Pglv-sacB-ulpl用BamHI和SacI双酶切， 将所述步骤b)中人工合成的基因片段P43-sacB-sumol-adipo用BamHI和Bglll双酶切， 依次构建入载体PGJ222,构建成命名为pZLS-128的质粒。
[0038] 3.重组表达载体pZLS-128在枯草芽抱杆菌WB700中的转化：
[0039] 将枯草芽抱杆菌WB700感受态细胞与质粒pZLS-128混合并将混合物转移至2mm 电转杯，在2. 5kV、5mV条件下电击；之后立即加入1000μ1预冷的枯草芽抱杆菌电转恢复培 养基RM，于37°C、225巧m条件下恢复培养比；500化pm离屯、后将管底菌体均匀涂布于含有 Cm5的LB固体平皿上，培养皿放置于37°C培养至单菌落出现；挑取单菌落置于LB液体培养 基振荡培养被提取质粒进行EcoRI和SacI双酶切鉴定和测序鉴定；将鉴定正确的单菌落定 义为BZLS128。
[0040] 4.重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达：
[0041] 将筛选得到重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的LB液体 培养基中，于30°C、225巧m的条件下振荡培养8~1化至595nm波长处的吸光值（0D595)达 到2~4,之后加入5ml质量百分比浓度为30%的麦芽糖溶液进行诱导表达；接着于25°C、 225巧m的条件下再继续振荡培养36~4她，1200化pm离屯、10分钟收集培养液上清，即为获 得的猪源脂联素蛋白。 柳42] 实施例2
[0043] 重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株分泌猪源脂联素的Tris-SDS-PAGE鉴定：
[0044] 枯草芽抱杆菌WB700菌株和重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株的发酵液上清经过冷 冻干燥后，使用Tri s-SDS-PAGE方法进行蛋白电泳分析及浓度比定。
[0045] 1. Tris-SDS-PAGE聚丙締酷胺凝胶（分离胶+浓缩胶）制备
[0046]
[0047] 2.相关试剂的制备 W48]a) 30 %聚丙締酷胺：丙締酷胺29g和Ig甲叉双丙締酷胺溶于100血d地2〇中；
[0049] b) 1XSDS凝胶上样缓冲液：50mmol/LTris-肥 1(Ph6. 8)，lOOmmol/L二硫苏糖醇 (临用时加入），2 % (m/V)SDS(电泳级），0. 1 %漠酪蓝和10 % (V/V)甘油；
[0050] C) 1XTris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸（电泳级）（pH 8. 3)，0. 1 % (m/V)SDS;(可配成5X胆存液，在900血去离子水中溶解15.IgTris碱和94g 甘氨酸，然后加入50血10% (m/V)电泳级SDS胆存液，用去离子水补至1000血即可）
[0051] d)憐酸缓冲液（PB巧：Na化 137mmol/L，KC1 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmol/L； 阳05引 e)染色液：25%异丙醇，10%乙酸和0. 04% (g/mU考马斯亮蓝R-250 ;
[0053]f)脱色液：5 %乙酸和7. 5 %甲醇；
[0054]g)200mg/mlIPTG:在8ml去离子水中溶解 2gIPTG，定溶至 10ml，用 0. 22μπι灭菌 滤器过滤除菌，分装成1ml小份，胆存于-20°C; 阳化日]h) 10%十二烷基硫酸钢（SDS):在900ml去离子水中溶解lOOg电泳级SDS，加热至 68°C助溶，加入几滴浓肥1调节溶液的抑值至7. 2,加水定容至1000ml，分装备用；
[0056] i) 10%过硫酸锭：称取Ig过硫酸锭溶于10血蒸馈水中；
[0057]j)1.5mol/LTris(p册.8):在 800ml去离子水中溶解 181.65gTris碱，定溶至 1000血，用浓盐酸调节抑值至8. 8 ;
[0058]k)1.5mol/LTris(p册.8):在 800ml去离子水中溶解 181.65gTris碱，定溶至 1000血，用浓盐酸调节抑值至6. 8 ;
[0059] 1)Imol/L二硫苏糖醇值TT):用 20ml0.Olmol/L乙酸钢溶液（pH:5.。溶解3. 09g DTT，过滤除菌后分装成1血小份，胆存于-20°C。 W60]