3.电泳及分析
[0061]电泳槽的内外槽加入1XSDS凝胶上样缓冲液，形成化is-SDS-PAGE电泳系统，用 80v恒电压处理2~3个小时，待漠酪蓝指示剂条带离开凝胶后停止电泳。考马斯亮蓝对胶 染色，脱色液脱色，用凝胶成像系统对脱色后的PAGE胶照相：见附图1。
[0062] 结果显示，重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株能明显分泌表达出26kDa左右的蛋白， 与猪源脂联素的理论值一致。
[0063] 在参照marker标准蛋白条带的基础上，脱色后凝胶经薄层凝胶扫描分析并经 band 5.0软件进一步分析计算，得出重组枯草芽抱杆菌BZLS128菌株所分泌表达的脂联素 的含量为218mg/l。
[0064] 实施例3 阳0化]枯草芽抱杆菌WB700菌株的高效转化方法：
[0066] 1.相关试剂准备
[0067]生长培养基（Growth medium,GM):蛋白腺lOg/1，酵母粉5g/l，PfeCl lOg/1，山梨 醇 0.5M，抑=7. 2 ;
[0068] 电转培养基巧lectroporration medium, EM):山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，葡萄糖 10% ; !；00例恢复培养基(^Recovery medium, RM):蛋白腺lOg/1，酵母粉5g/l，PfeCl lOg/1，山 梨醇0. 5M，甘露醇0. 38M。
[0070] 2.枯草芽抱杆菌WB700菌株的转化
[0071] 1)接种枯草芽抱杆菌WB700菌株于3mlLB培养基中，过夜培养；
[0072]2)取2. 6ml过夜培养物接入40mlGM中，37°C，200巧m培养至0D600 = 0. 85~ 0. 95；
[0073] 3)将菌液冰水浴lOmin，然后5000g，5min，4°C离屯、收集菌体；
[0074] 4)用50ml预冷的EM，重新吹悬菌体，5000g，5min，4°C离屯、去上清，如此漂洗4次； 阳07引 W将洗涂后的菌体吹悬于1mlEM中，每EP管分装60μ1菌体；
[0076]6)向60μ1感受态细胞中加入50ngDNA(1~8μ1)，冰上解育2min，加入预冷的 电转杯中进行电击；
[0077] 7)电击完毕取出杯子并立即加入1mlRM，37°C，200巧m，复苏化后涂板，并于37°C 过夜培养。 阳〇7引序列表说明 阳0巧]SEQIDNO. 1为Pglv-sacB-ulpl序列，即人工合成含枯草芽抱杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽抱杆菌果聚糖薦糖酶信号肤（sacB)和编码sumo蛋白酶的表达操 纵子基因的融合DNA片段：
[0081] 沈QIDNO. 2为P43-sacB-sumol-adipo序列，即人工合成枯草芽抱杆菌高效启动 子P43、编码枯草芽抱杆菌果聚糖薦糖酶信号肤（sacB)和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋 白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段：
【主权项】
1. 一种生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： 1) 可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源 脂联素融合蛋白的操纵子的合成，包括以下步骤： a) 人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗 糖酶信号肽sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulpl; b) 人工合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽 sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融 合DNA片段P43-sacB-sumol_adipo; 2) 猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS-128的构建，包括以下步 骤： 将所述步骤中a)中人工的DNA片段Pglv-sacB-ulpl用BamHI和SacI双酶切，将所述 步骤b)中人工合成的DNA片段P43-sacB-sumol_adipo用BamHI和Bglll双酶切，依次构 建入载体PGJ222,构建成命名为pZLS-128的质粒； 3) 重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化； 4) 重组枯草芽孢杆菌BZLS-128在摇瓶中的诱导表达。2. -种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤3)中重组表 达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化包括以下步骤： 将枯草芽孢杆菌WB700感受态细胞与质粒pZLS-128混合并将混合物转移至2mm电转 杯，在2. 5kV、5mV条件下电击；之后立即加入1000μ1预冷的枯草芽孢杆菌电转恢复培养基 RM，于37°C、225rpm条件下恢复培养lh;5000rpm离心后将管底菌体均勾涂布于含有Cm5的 LB固体平皿上，培养皿放置于37°C培养至单菌落出现；挑取单菌落置于LB液体培养基振荡 培养被提取质粒进行EcoRI和SacI双酶切鉴定和测序鉴定；将鉴定正确的单菌落定义为 BZLS128。3. -种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤4)中重组枯 草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达包括以下步骤： 将筛选得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的LB液体培养 基中，于30°C、225rpm的条件下振荡培养8~12h至595nm波长处的吸光值0D595达到2~ 4,之后加入5ml质量百分比浓度为30%的麦芽糖溶液进行诱导表达；接着于25°C、225rpm 的条件下再继续振荡培养36~48h，12000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为获得的猪 源脂联素蛋白。4. 一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤a)中人工 合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽 sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulpl，其核苷酸序 列为： ggatccggcatgtatccgaatcgtacaaaagaaccttttcataagaattggaagggcgtatattcacttaa aattcacagttggtgagactttaagattacaaaaaaggtaaaaaaaccaaatctctcagacataaggcaaatgaga aatttcccgctctatgggaaaaaacactaaagttgatcaaatgacctaagtgcgccaaacgtgttacgggacgagct atctcatggtataaatggaattgtaaaatttatcaaggaggtcggaattcatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaa gcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgccggcctggttccggaact gaatgaaaaagatgatgatcaagttcaaaaagcactggcatctagagaaaatacacaactgatgaatagagataata ttgaaattacagttagagattttaaaacactggcaccgagaagatggctgaatgatacaattattgaattttttatg aaatatattgaaaaatcaacaccgaatacagttgcatttaattcatttttttatacaaatctgtcagaaagaggcta tcaaggcgttagaagatggatgaaaagaaaaaaaacacaaattgataaactggataaaatttttacaccgattaatc tgaatcaatcacattgggcactgggcattattgatctgaaaaaaaaaacaattggctatgttgattcactgtcaaat ggcccgaatgcaatgtcatttgcaattctgacagacctgcaaaaatatgttatggaagaatcaaaacatacaattgg cgaagattttgatctgattcatctggattgcccgcaacaaccgaatggctatgattgcggcatttatgtttgcatga atacactgtatggctcagcagatgcaccgctggattttgattataaagatgcaattagaatgagaagatttattgca catctgattctgacagatgcactgaaatagctcgagaaaaataggaaggagctgaccgaacagggcagctcctttca taaagtaaagatctgagctc〇5. -种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤b)中人工 合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和含编 码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段 P43-sacB-sumol_adipo,其核昔酸序列为： ggatccggcatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcg attatgtaaaatataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacgaattcatgaatatcaaaa agtttgctaaacaagctacagtccttacgttcacgacagctctgcttgctggaggagctacgcaggcttttgctatg ggccatcaccatcatcatcacggtagcgcaaatcaagaagaagataaaaagcctggcgatggcggcgcacatattaa cctgaaagtcaaaggccaagatggcaatgaagttttctttcgcatcaaacgcagcacacaactgaagaaactgatga atgcatattgcgatcgccaaagcgttgatatgaatagcattgcatttctgtttgatggccgccgcctgcgcgcagaa cagacgccggatgaactggacatggaagatggcgatgaaatcgatgcaatgcttcatcaaaccggtggcatgctgct gctgggcgcagttctgctgctgctggcactgccgagcctgggccaagaaacaacagaaaaaccgggcgcactgctgc cgatgccgaaaggcgcatgcgcaggctggatggcaggcattccgggccatccgggccataatggcacaccgggccgc gacggccgcgacggcgttccgggcgaaaaaggcgaaaaaggcgacacaggcctgacaggcccgaaaggcgacacagg cgaaagcggcgttacaggcgttgaaggcccgcgcggctttccgggcattccgggccgcaaaggcgaaccgggcgaaa gcgcatatgtttatcgcagcgcatttagcgttggcctggaaacacgcgttacagttccgaatatgccgattcgcttt acaaaaattttttataatcaacaaaatcattatgacgttacaacaggcaaatttcattgcaatattccgggcctgta ttattttagctttcatattacagtttatctgaaagacgttaaagttagcctgtataaaaaagacaaagcagttctgt ttacatatgaccaatatcaagacaaaaatgttgaccaagcaagcggcagcgttctgctgtatctggaaaaaggcgac caagtttggctgcaagcatatggcgacgaagaaaataatggcgtttatgcagacaatgttaatgacagcatttttac aggctttctgctgtatcataatattgaatagctcgagaaaaataggaaggagctgaccgaacagggcagctcctttc ataaagtaaagatctgagctc〇
【专利摘要】本发明提供了一种生产猪源脂联素的方法，通过人工合成可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子，进而克隆得到了猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS-128，并将其电转化进入枯草芽孢杆菌WB700菌株的感受态细胞中得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株，重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶经诱导发酵后可得到猪源脂联素蛋白。本发明具有表达系统简单、可用于大规模生产且生产成本低等优点，为猪源脂联素的商业应用提供了必要的技术支持。
【IPC分类】C12N15/75, C07K14/575
【公开号】CN105254745
【申请号】CN201510654844
【发明人】姬生跃
【申请人】姬生跃, 李伟丽, 李恒鑫, 黄晶
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月10日