一株高产谷胱甘肽的果酒酵母及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株高产谷脫甘肤的果酒酵母及其应用，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上最大的水果生产国，而水果深加工业一直很薄弱，为发展果酒产业 开辟了良好时机。作为发酵酒，果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有 丰富的生理活性物质，适量饮用，可舒筋活络，调整新陈代谢，促进血液循环，同时具有控制 体内胆固醇水平，利尿、激发肝功能和抗衰老等功效，具有较强的保健作用。
[0003] 果汁褐变是苹果汁或山植汁生产中面临的四大技术难题之一。褐变不仅影响果汁 的外观、风味，而且还会造成营养物质丢失，甚至变质。酶促褐变主要发生于果汁生产初期， 苹果经过破碎及棒汁工序，多酪物质与PP0充分接触，引起果汁酶促褐变。苹果酒或山植酒 氧化褐变是苹果酒或山植酒生产与胆存过程中的一个重要问题，既影响色泽，又影响风味， 重者出现混浊与沉淀，造成质量不稳定问题。果酒褐变极易发生在加工及储藏过程中，会使 果酒颜色加重，从金黄色变为砖红色、氧化感增强、果香变淡等问题。褐变不仅影响产品色 泽，影响销量，另外也造成一些营养物质的损失。目前对果酒褐变的主要抑制方法是抗氧化 剂的添加，如二氧化硫、抗坏血酸、茶多酪、心半脫氨酸、巧樣酸等，但各有弊端。二氧化硫是 果酒酿造及胆存过程中应用的一种化学添加剂，具有很好的抗氧化及抗菌的作用。但大量 研究结果表明，二氧化硫对人体健康会产生很大的危害。在我国，按照GB/T15037的规定， 游离二氧化硫被划为B类不合格，当一个果酒中其他项目完全合格而仅仅游离二氧化硫超 标时，该酒将被划为不合格。而抗坏血酸极易氧化分解，可与游离氨基酸反应，生成红色素 及黄色素，造成褐变。为此，找到替代二氧化硫的抗氧化及抗菌作用的物质或其他方法，已 经成为果酒行业的研究热点。
[0004] 作为发酵酒，果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生 理活性物质。随着人们对食品安全及功能性了解和认识的深入，果酒广受消费者喜爱和认 可，也必将在国内形成一个巨大的消费市场，而果酒抗氧化剂的添加也日益成为市场关注 的焦点。谷脫甘肤是由谷氨酸、半脫氨酸和甘氨酸结合而成具有重要抗氧化性的Ξ肤化合 物，具有重要的生理功能。因此，筛选一株高产谷脫甘肤的酵母菌，抑制果酒在发酵过程中 的氧化褐变，降低二氧化硫等抗氧化剂的使用，提高苹果酒或山植酒的抗氧化性。本发明利 用生物方法减少褐变对果酒品质的影响，在不引入外源物质的前提下减少褐变对果酒品质 的影响，为高品质果酒的开发提供参考，在提高果酒安全性的前提下降低成本，具有广阔的 研究前景。
【发明内容】
阳〇化]为了克服上述问题，本发明得到了一株高产谷脫甘肤（GSH)的果酒酵母，达到抑 制果酒在发酵过程中发生氧化褐变，增强果酒的抗氧化性的目的，为高品质果酒的生产提 供思路。
[0006]本发明的高产谷脫甘肤的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)，已于2015年9 月15日保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC N0:M2015544〇
[0007] 所述酿酒酵母是从山植皮中分离后的酿酒酵母CCTCCN0:M2015119经诱变筛选 得到的。与出发菌株相比，本发明的酿酒酵母的G甜胞外分泌量得到显著提高，发酵酿造的 苹果酒或山植酒GSH含量是出发菌株的5-9倍。
[0008] 所述酿酒酵母，具有如下性能：
[0009] (1)发酵生产谷脫甘肤，含量可达106mg/L，其中胞外产量达到70mg/LW上，占总 含量的66 %W上；
[0010] 似可耐受1. 4~1. 6g/L的氯化锋；
[0011] (3)发酵果酒酒精度可达到12%vol;
[0012] (4)该菌株可在12-14%乙醇含量的培养基中生长巧耐受14%的乙醇；
[0013] (5)该菌株可耐受抑为2的酸性环境；
[0014] (6)用于发酵生产果酒，可W抑制发酵过程中果酒的氧化褐变。
[0015] 所述酿酒酵母是从CCTCCN0:M2015119的酿酒酵母紫外诱变得到的，诱变方法 具体如下：诱变出发株在YTO培养基中活化14~1她，接入液体培养基，培养至对数生长 期（1地），取对数生长期菌液5血，离屯、并W无菌生理盐水洗两次，还原至原体积，转入直径 9cm培养皿中，磁力揽拌，在紫外灯（功率15w，距离30~35cm)照射50~60s(致死率控 制60~70 %左右）。
[0016] 本发明还提供了一种利用所述酿酒酵母生产谷脫甘肤的方法。
[0017] 所述方法是将酵母W8-10 %接种量接种于发酵培养基中，溫度25-30°C，转速 150-200r/min，培养 24-3化。
[0018] 所述发酵培养基含有：葡萄糖30g/l，酵母提取物lOg/l，硫酸锭6g/l，憐酸氨二钟 3邑/1，憐酸二氨钟0. 5g/l，硫酸儀0.Ig/L，抑3. 5,糖度为15。Brix。
[0019] 本发明还提供了所述酵母在生产果酒方面的应用。
[0020] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是调节果汁还原糖量为160-200g/l，pH 3. 2-3. 6,然后按6-10% (v/v)的接种量将酵母种子液接入果汁中，在溫度20-25°C下发酵 5-lOdo
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：（1)将原料清洗、去核、棒 汁、离屯、得到果汁；（2)调整成分；（3)接种保藏编号为CCTCCN0:M2015544的酵母；(4)酒 精发酵；（5)陈酿；(6)过滤；(7)除菌。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤（2)的调整成分是指调整抑为3. 2-3. 6,还 原糖量为160-200g/L;不经任何其它成分调节，直接用来发酵。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤（3)中酵母的接种量为6-10% (v/v)。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述步骤（4)中酒精发酵的溫度为20-25°C，发酵时 间为5-lOd。
[00巧]在本发明的一种实施方式中，所述果酒是W苹果汁或山植汁为原料的苹果酒或山 植酒。
[00%] 在本发明的一种实施方式中，所述应用还包括杀菌之后的灌装步骤。
[0027] 本发明的有益效果主要体现在：
[0028] (1)本发明的酿酒酵母菌是从山植皮中分离，经紫外诱变筛选得到的，其发酵生产 谷脫甘肤，含量可达106mg/L，其中胞外产量达到70mg/l，占总含量的66%左右；该菌株可 在12-14%乙醇含量的培养基中维持一定生长，且对抑的耐受性较强，对酸性环境的适应 能力较强于其它菌株；
[0029] (2)本发明的酿酒酵母适合在酸度较高、不经任何成分调节的苹果汁或山植汁中 进行正常的酒精发酵，产谷脫甘肤能力显著高于对照组酵母菌株；用于发酵生产果酒，可W 抑制发酵过程中果酒的氧化褐变；
[0030] (3)由本发明菌株发酵酿造的苹果酒或山植酒G甜含量最高可达到14-18111邑/1，约 为对照组苹果酒或山植酒的5-9倍；得到的苹果酒或山植酒澄清度较高，抗氧化性较高，褐 变值显著低于对照组果酒。酒香和果香醇厚，口味柔和纯正，具有苹果酒或山植酒的典型 性，适用于高品质果酒的生产。
[0031] 生物材料保藏：
[0032] 酿酒酵母CCTCCN0:M2015544,分类学命名为酿酒酵母YlSSaccharomyces cerevisiaeY18,于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，保藏地址 为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCN0:M2015544。
【附图说明】 阳〇3引图1 :生长曲线；
[0034] 图2:酵母菌株发酵力比较；
[0035] 图3:酵母菌株耐乙醇能力比较；
[0036] 图4:酵母菌株耐抑能力比较；
[0037] 图5:发酵过程中谷脫甘肤含量变化； W38] 图6 :发酵过程中色度变化；
[0039] 图7 :发酵过程中抗氧化能力变化。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方法不限于此。 阳OW 培养基的配方： 阳0创 YTO培养基：酵母粉lOg/l，鱼粉蛋白腺20g/l，葡萄糖20g/l，pH自然，0.IMPa高压 灭菌15min。固体培养基添加琼脂20g/L。
[0043] 苹果汁或山植汁活化培养基：调节苹果汁或山植汁还原糖量为160-200g/l，然后 用巧樣酸调整到pH3.5,按6% (v/v)的接种量接入培养基，在25°C下发酵培养2地。
[0044] 苹果汁或山植汁发酵培养基：调节鲜棒苹果汁或山植汁还原糖量为160-200g/L， 然后用巧樣酸调整到抑3. 2-3. 6,按6-10% (v/v)的接种量接入培养基，在20-25°C下发酵。
[0045] 实施例1 :酵母菌株生长曲线测定
[0046] 向100血灭菌的YTO液体培养基中接入一环酵母菌，28 °C下，150巧m振荡培养 2地，每隔化取样5mU用分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光值（W未接菌的YPD 培养液做空白试验），若菌体浓度过大，用蒸馈水进行适量稀释后再进行测定。W培养时间 为横坐标，ODe。。为纵坐标，绘制出生长曲线图，确定对数生长期，如图1所示。
[0047] 实施例2 :酵母菌诱变柳4引（1)诱变时间确定
[0049] 诱变出发株在YTO培养基中活化1她，接入液体培养基，培养1地，取对数生长期菌 液5mU离屯、并W无菌生理盐水洗两次，还原至原体积，转入有磁力揽拌的无菌培养皿中，在 功率15W紫外灯下，距离35cm，照射一定时间。将照射后的菌悬液在无菌室避光（在红光下 操作）条件下适当稀释后涂l.Og/L氯化锋平板。平板倒置于30°C恒溫箱中，避光培养2d。 待平皿长出菌落后，根据菌数计算紫外诱变各时间致死率，致死率70%时诱变时间为60s。
[0050] (2)氯化锋浓度确定
[0051] 将紫外诱变后的菌体系列稀释后分别涂布于培养基上，计算其菌数与乙醇浓度的 关系，根据菌数确定致死率在70%左右时，氯化锋浓度为1. 6g/L。 阳05引实施例3:酵母性能比较
[0053] 将菌株接种于种子培养基中，摇床培养24h后，W10%接种量接种于发酵培养基 中，溫度30°C，转速150-2(K)r/min，培养30h。W酵母菌的生物量及胞外G甜含量为指标，比 较了诱变后筛选的不同酵母菌的产谷脫甘肤能力，结果如表1所示。编号Y-11，即为本发明 的酿酒酵母，保藏编号为CCTCCN0:M2015544,其G甜总量可达106111旨/1，且胞外含量达到 了总量的66%，胞外分泌越多则表明发酵液中含量越大，W充分发