大丽轮枝菌磷脂酶靶基因片段及其干扰载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及大丽轮枝菌憐脂酶祀基因片段W及该祀基因片段所转录的RNA，还设 及含有所述憐脂酶祀基因片段的RNA干扰载体，本发明进一步设及所述大丽轮枝菌憐脂酶 祀基因W及该祀基因片段所转录的RNA或干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的 应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌（Verticillium d址liae)是一种危害极其严重±传维管束真菌 病害，寄主范围非常广泛，能侵染棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃馨、甜瓜、西 瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等两百多种经济作物，给中国乃至世界造成 极大的经济损失(HillocksI R. Cotton diseases. Centre Agriculture Bioscience International, 1992:240~257.)，而且其后期产生的微菌核可W在极其恶劣的环 境下存活数年甚至更长的时间（Klosterman SJ, Atall址ZK, Vallad GE, Subbarao KV:Diversity, pathogenicity, and management of Verticillium species.Ann Rev Phytopathol2009, 47:39 - 62.)，主要存在于±壤耕作层，是大丽轮枝菌在±壤中的主要 存活结构和初侵染源，用药剂难于防治，成为农业物生产发展的瓶颈（化adin EF，Thomma BP:Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V.d址liae and V. a化o-atrum. Mol Plant Pathol 2006, 7:71 - 86.)。鉴于其严重的危 害性，探究大丽轮枝菌致病机理和寄主与病原菌之间的相互作用机制一直是研究的热点 (Luo X, Xie C, Dong J, Yang X, Sui A. Interactions between Verticillium dahliae and its host:vegetative growth, pathogenicity, plant immunity. Applied microbiology and biotechnology 2014, 98:6921-6932.)。如何增强寄主植物体对大丽轮枝菌的抗病 性是急待解决的问题。然而大丽轮枝菌致病机理的研究仍停留在初步探索阶段。最近 研究表明：大丽轮枝菌入侵过程中分泌蛋白主要参与寄主植物细胞壁降解、活性氧应答， 还包括一些效应因子、新陈代谢蛋白因子等，或许运些分泌蛋白参与了大丽轮枝菌的渗 透侵染寄主植物的根部，达到入侵的目的（Hogenhout SA, Van der Hoorn RA, Terauchi R, Kamoun S. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms. Molecular plant-microbe interactions 2009, 22:115-122.Chu J, Li WF, Cheng W, Lu M, Zhou KH, Zhu HQ,Li FG, Zhou CZ. Comparative analyses of secreted proteins from the phytopathogenic fungus Verticillium dahliae in response to nitrogen starvation.Biochimica et Biophysica Acta化BA)-Proteins and Proteomics 2015, 1854:437-448.)。
[0003] 大丽轮枝菌如何渗透到寄主细胞和如何阻碍寄主细胞的防卫机制至今还没有文 献报道。探索大丽轮枝渗透寄主细胞机制，寻找参与渗透过程中关键的蛋白因子或是信号 诱导因子的研究显得尤其重要，并利用"反向遗传学"培育抗病的新材料品种提供了一条新 的策略。
[0004] 麟脂是真菌生物膜的主要组成成分，在生物体的新陈代谢中发挥着不可替代 的作用。麟脂酶（phospholipase,PL)广泛存在于真菌生物体内，是水解麟脂的一类 酶，因其水解的醋键不同，分为麟脂酶AUPLA1)、麟脂酶A2巧LA2)、麟脂酶B巧LB)、麟脂 酶C巧LC)和麟脂酶D巧LD)。麟脂酶AUPLJU)、麟脂酶A2巧LA2)和麟脂酶B巧1的是乙 醜水解酶，麟脂酶C巧LC)和麟脂酶IKPLD)为麟酸二醋酶，水解麟酸二醋键Whannoum Μ.Potentialroleofphospholipasesinvirulenceandfungalpathogenesis. Clinicalmicrobiologyreviews2000, 13:122 - 143.)D5葬脂酶的激活不仅对细胞的结 构和稳定性有很重要的作用，而且调控许多重要的细胞生理功能，如信号转导、细胞骨架组 装、防御反应等（HuangP,FrohmanΜΑ.ThepotentialforphospholipaseDasanew therapeutictarget.ExpertOpiniononTherapeuticTargets2007,11:707 - 716. CoxGM，McDadeHC，QienSC，GottfredssonM，Wri組tLC，SorrellTC，Leidich SD,CasadevallA,PerfectJ民.Extracellularphospholipaseactivityisavirulence factorforCryptococcusneoformans.MolecularMicrobiology2001，39:166 - 175. JonesJDG，DanglJLHieplantimmunesystem.Nature2006, 444:323 - 329.Pinosa F,BuhotN,KwaaitaalM,FahlbergP,Thordal-ChristensenH,EllerstromM,Andersson MX.ArabidopsisphospholipaseDδisinvolvedinbasaldefenseandnonhost resistancetopowdeiTmildewfungi.Plantphysiology2013,163:896-906·)。研究 发现，真菌的麟酸二醋酶在真菌细胞壁的完整性途经中发挥着重要作用，是调控细胞壁合 成的重要蛋白因子（YinZY，TangW，WangJZ，LiuXY，YangLN，GaoCY，ZhangJLZhang HF,ZhengXB,WangP,ZhangZG.PhosphodiesteraseMoPdeHtargetsMoMcklofthe conservedMAPkinasesignalingpathwaytoregulatecellwallintegrityin riceblastfungusMagnaportheoryzae.MolecularPlantPathology，2015.Lesage GandBussey比CellwallassemblyinSaccharomycescerevisiae.Microbiology andmolecularbiologyreviews2006, 70:317-343.LevinDE.Cellwallintegrity signalinginSaccharomycescerevisiae.Microbiologyandmolecularbiology reviews2005, 69:262-291.LevinDE.民egulationofcellwallbiogenesisin Saccharomycescerevisiae:thecellwallintegritysignalingpathway.Genetics 2011，189:1145-1175.)。鉴于前人的研究结果，大丽轮枝菌的细胞壁成分及其跨膜蛋白 在寄主细胞的渗透和防卫机制中的作用发挥重要的作用，可W推测麟脂酶或许参与大丽 轮枝菌的渗透入侵和防卫过程。目前有关大丽轮枝菌的麟脂酶的功能分析还未见报道， 因此利用已经成功测序并公布在BroadInstitute(ht化：//www·broadinstitute.org/ annotation/genome/verticillium_dahliae/GenomeDescriptions.html冉VD_VdLs. 17) 上的大丽轮枝菌小种V化s. 17基因组数据信息化lostermanSJ，AtallahZK，Vallad GE,SubbaraoKV:Diversity,pathogenicity,andmanagementofVerticilliumspecies. Annualreviewofph^opathology2009, 47:39 - 62·)，查找到分别位于不同染色体上 (第一条染色体，第兰条染色体），且序列信息不同的2个麟脂酶基因，命名为麟脂酶UPL1， 位于第一条染色体上），麟脂酶3 (化3,位于第S条染色体上），从这些麟脂酶基因中筛选得 到与抗大丽轮枝菌有关的靴基因对于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性将具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供大丽轮枝菌（Verticilliumd