经过共培养的烟草外植体转移到含有抗生素的抗性芽筛选培养基（MS+NAA 0. 2mg/L+6-BA2mg/L+KanlOOmg/L+Carb500mg/L)中进行培养，光照周期为 1 化光照 /她 黑暗，2~3周后即可生芽。待抗性芽生长至1~2cm高时，切下小芽转入生根培养基 (MS+KanlOOmg/L+Carb500mg/L)中诱导生根，1~2周后就会有不定根形成。
[0059] 获得烟草的转化植株W后，对其进行分子鉴定。提取转化苗的总的基因组为模 板，WVdPLl-1-J-F/R，VdPLl-2-J-F/R,VdPLl-3-J-F/R,VdPL3-l-J-F/R，VdPL3-2-J-F/ R，VdPL3-3-J-F/R，VdPL3-4-J-F/R(引物序列见表1)，进行PCR分子检测，检测为阳性苗的 植株进行继代培养，W获得纯合的阳性烟草植株，为下一步的抗病性实验准备。
[0060] 1. 3转基因烟草植株的抗病性试验与真菌生物量的检测和分子检测
[0061] 分别将野生型烟草和已获得的7段不同祀基因片段的（每个祀基因片段各挑选Ξ 个不同的株系）烟草种子栽培在无菌的环境下，待幼苗长至屯到九片真叶时，用已准备好 的5X1〇6抱子/mL的野生型菌株的抱子悬浮液分别接种获得的二十一组不同祀基因片段 不同株系的转基因烟草幼苗，每组设置Ξ小组（十棵幼苗）重复，十二天W后观察植株的感 病状况，并统计植株的病情指数。
[0062] 利用qRT-PCR技术检测感病烟草植株内大丽轮枝菌的生物量变化。本发明分别用 感病的野生型和屯段转祀基因片段获得本生烟植株的地上1cm茎段作为qRT-PCR大丽轮枝 菌生物量检测的材料，提取感病烟草植株的总DNA，W本生烟的actin(引物序列见表1)基 因作为内参基因，大丽轮枝菌的核糖体RNA基因狂29511)作为真菌生物量的检测基因，弓I 物Vd-F/Vd-R(引物序列见表1)是基于核糖体RNA基因的口S1和口S2区域，检测感病本生 烟中真菌的生物量，从分子生物学角度确定转基因烟草植株对大丽轮枝菌的抗病性等级。
[0063] 2、实验结果
[0064] 2. 1转祀基因烟草植株的获得
[0065] 通过农杆菌介导的本生烟的稳定遗传转化，将含有不同憐脂酶基因不同祀标区段 的干扰载体稳定遗传转化到本生烟草，经lOOmg/L的卡那霉素筛选最终获得转基因烟草植 株。对获得的转基因烟草植株进行PCR检测（图4)，每段祀基因均获得多个不同的阳性转 化株系，分别随机挑选Ξ个转基因株系进行下一步的抗病性分析。
[0066] 2. 2转祀基因烟草植株的抗病性分析和真菌生物量的分子检测
[0067] 为了确定转憐脂酶祀基因片段的本生烟植株对大丽轮枝菌的抗性等级，是否能达 到免疫等级，对其进行抗病性试验检测分析。本发明W野生型本生烟植株和转憐脂酶祀基 因片段本生烟植株为大丽轮枝菌的寄主，待植株长至屯到九片真叶时接种相同浓度的抱子 巧X1〇6抱子/mL)悬浮液在第八天、第十天、第十二天W后观察植株的感病情况病统计病情 指数，结果发现：在接菌第十二天W后，获得憐脂酶基因干扰片段的转基因烟草植株的感病 症状极显著低于野生型植株。获得VdPLl-1 (核巧酸序列为SEDNo. 1所示）、VdPLl-2 (核 巧酸序列为SEDNo. 2所示）、VdPLl-3 (核巧酸序列为SEDNo. 3所示）、VdPL3-l(核巧酸序 列为沈QIDNo. 4所示）、VdPL3-2 (核巧酸序列为沈QIDNo. 5所示）、VdPL3-3 (核巧酸 序列为SEQIDNo. 6所示）、VdPL3-4(核巧酸序列为SEQIDNo. 7所示）憐脂酶干扰片段 的转基因烟草植株仅地上茎基部出现两到Ξ片叶片萎焉，其他W上部分未出现感病症状， 植株表现出抗病甚至达到高抗性。其中获得祀基因片段VdPLl-3(核巧酸序列为SEDNo. 3 所示）的转烟草植株基本没有出现感病症状，与未接菌的对照植株基本一致，植株达到免 疫等级（病情指数基本是0);获得转祀基因片段VdPLl-l、VdPLl-2的烟草植株表现为高抗 (病情指数在15%W下）；获得转祀基因片段VdPL3-l、VdPL3-2、VdPL3-3、VdPL3-4的烟草 植株表现为抗病或中抗（病情指数在15-30%或30% -40% )。而野生型烟草植株出现明 显的感病症状，在接菌第十二天W后，植株出现黄化、萎黨、枯死症状（图5)。
[0068] 对接菌十二天后的转憐脂酶祀基因片段的本生烟植株和野生型本生烟植株中真 菌生物量的检测结果发现：野生型烟草植株中大丽轮枝菌的生物量都极显著高于获得的7 段不同的转憐脂酶祀基因片段烟草植株中生物量，差异显著倍数都在10W上，有的甚至高 达100倍（图5)。而且检测结果显示：转憐脂酶祀基因片段VdPLl-3的烟草植株中仅仅检 测到痕量大丽轮枝菌生物量，与未侵染的对照植株基本一样（图5)。
[0069] 综上结果表明：获得的7段不同的憐脂酶祀基因片段的烟草转化植株VdPLl-1、 VdPLl-2、VdPLl-3、VdPL3-l、VdPL3-2、VdPL3-3、VdPL3-4 对大丽轮枝菌的抗病性极显著提 高，植株达到抗病的水平W上，尤其获得VdPLl-3干扰片段的转基因烟草植株对大丽轮枝 菌抗病性达到免疫的水平。
[0070] 综上，本发明通过病毒诱导的基因沉默技术（VIG巧将大丽轮枝菌憐脂酶基因7 段祀基因序列导入本生烟中使其瞬时表达dsRNA，并进行大丽轮枝菌接种，发现导入7段祀 基因片段的本生烟植株的抗病性都显著提高，而且其中有3段祀标序列的抗病性极显著提 高。本发明利用RNAi技术，进一步构建憐脂酶基因屯段祀基因序列的稳定遗传干扰载体， 转化本生烟，获得转基因的烟草植株，其对大丽轮枝菌的抗病性显著增强，尤其是转化获得 的VdPLl-3基因片段的烟草植株的抗病性最强，对大丽轮枝菌的抗病性表现出高抗，甚至 达到免疫等级。因此，本发明获得憐脂酶屯段祀基因序列的稳定遗传干扰载体，转化本生烟 提高烟草对大丽轮枝菌的抗病性，将其转入农作物中，有望获得高抗大丽轮枝菌的新试验 材料，应用于棉花、番茄、马铃馨、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生等抗病育种的实践生产中。
【主权项】
1. 大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae)磷脂酶祀基因片段，其特征在于：其核苷酸序 列为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5、SEQIDNo. 6 或SEQIDNo. 7所示；优选的，其核苷酸序列为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2或SEQIDNo. 3 所示；更优选的，其核苷酸序列为SEQIDNo. 3所示。2. 由权利要求1所述磷脂酶靶基因片段所转录的RNA。3. 含有权利要求1所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体；优选的，所述RNA干扰载 体是Gateway干扰载体。4. 一种构建权利要求3所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所 述的磷脂酶靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得； 优选的，通过BP反应，将权利要求1所述的磷脂酶靶基因片段连接至pD0NR207中，再 通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2 (I)，0中，得到Gateway干扰载体。5. 权利要求1所述磷脂酶靶基因片段或权利要求2所述的RNA在提高植物对大丽轮枝 菌的抗病性中的应用。6. 按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1)构建含有权利要求1 所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物 细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。7. 权利要求3所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。8. 按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1)将权利要求3所述 RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因 植物。9. 一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)构建含有权利要求1所述磷脂酶靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰 载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品 种。10. 按照权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物； 优选的为农作物，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或 多种。
【专利摘要】本发明公开了大丽轮枝菌磷脂酶靶基因片段及其干扰载体和应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。本发明通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)将大丽轮枝菌磷脂酶靶基因的基因序列导入本生烟中瞬时表达dsRNA，筛选到能极显著提高植物抗病性的靶基因。本发明进一步利用RNAi技术，构建稳定遗传干扰载体并转化本生烟，转化结果表明转基因烟草植株极显著提高烟草对大丽轮枝菌的抗病性，表现出高抗，甚至达到免疫等级。本发明提供大丽轮枝菌磷脂酶靶基因片段以及RNA干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病能力以及培育抗大丽轮枝菌转基因植物新品种。
【IPC分类】C12N15/55, C12N15/82, C12N15/66, A01H5/00
【公开号】CN105255918
【申请号】CN201510794698
【发明人】程红梅, 齐希梁, 苏晓峰, 郭惠明
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月17日