半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，尤其是DNA合成技术领域，具体涉及半导体芯片高 通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 合成生物学是二十一世纪新兴的一门交叉学科，其运用工程学的研究思路去设 计改造基因、生物元件'生物途径，甚至是整个基因组，在生物，医药，环保，能源和农业等领 域有着广泛的应用前景。合成生物学技术主要包括：双链DNA的合成，调控元件的合成，操 纵子合成，基因合成等；其中基因合成是合成生物学的主要组成部分，是合成生物学的基础 和骨架。基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术，与寡核苷酸合成单链DNA不 同，基因合成合成的是双链DNA分子。基因合成是获取目的基因的手段之一，相对于从已有 生物中获取基因来说，基因合成无需模板，不受基因来源限制，可以合成自然界中极难获 得或者不存在的基因。
[0003] 基因合成具有以下优点：基因合成所需的合成周期短，合成序列100%正确；具有 更大的灵活性，可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改，方便后续实验；通过基因合成 合成的基因可以进行密码子优化，使其在各种生物表达体系中都能得到良好表达。基因合 成已经广泛应用于克隆人鼠抗体或重组抗体，合成不同的基因突变株、SNP、或其它突变株， 合成DNA疫苗以及大量合成用于微芯片的cDNA等。
[0004]Gibson等温组装法（Gibsonisothermalassembly)是目前使用的最为广泛的基 因合成方法，这种方法在恒温条件下使用一步组装技术来组装基因，即利用5'核酸外切 酶，DNA聚合酶及连接酶的特性在体外将具有重叠区的多个DNA片段组装起来，达到基因 合成的目的。该方法既可以组装较小的基因，也可以组装较大的基因片段，因此应用广泛， 但是该方法在合成高GC含量，高度重复的正向或者反向重复序列时，具有明显的局限性。 更重要的是在组装大片段，生物途径合成，或者组装基因组时，因为对引物的需求量巨大， 传统的引物合成方法因为无法一次性高通量合成组装大片段，元件库，生物途径或者基因 组所需要的大量引物，耗时耗力，而且传统的化学合成方法合成引物成本高昂。
[0005] 进入21世纪以来，随着生命科学的发展和下一代测序技术的进步，包括人类，水 稻等越来越多的物种的基因组已经测序完成，利用已经得到的基因组序列研究具有重要 意义的生物途径，生物元件库等，成为一项重要的研究课题。因此，低成本、高通量的基因合 成和蛋白质表达的精确调控是合成生物学的一个关键技术问题。传统的基因合成和组装方 法面临越来越大的困难和挑战，难以满足市场和科研对基因合成的需求。为了提高基因合 成通量并降低成本，有必要开发下一代的DNA合成和组装技术。
[0006]生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子 学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，目前已经商业化的有各 种动物的表达谱芯片，捕获芯片，miRNA芯片等。生物芯片具有高通量，微型化和自动化等 特点，生物芯片的出现为大规模高通量低成本的新一代DNA合成和组装提供了可能。
[0007] 现在技术中常用的芯片合成核苷酸再以此为原料组装双链DNA的方法，基因合成 和错误修复的方法步骤繁琐，集成化和微型化程度低，成本较高，因此现在需要一种方法将 半导体芯片合成技术和DNA大片段组装技术融合在一起，利用电化学半导体芯片和DNA大 片段组装技术成功开发了下一代DNA合成平台。此平台应该具有如下特点：1.合成成本 低，通过芯片技术合成的基因比传统的以PCR为基础的基因合成成本低90%以上；2.高通 量，DNA芯片技术具有高通量的特点，可以一次性同时合成上百万条引物，每条引物长度可 达200nt,用于后续的实验。
【发明内容】
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装 双链DNA的方法，该方法利用半导体芯片技术，使用带有生物素标记的flank序列进行第一 轮扩增，使半导体芯片所合成的核苷酸大量增加，然后进行第二轮PCR拼接引物，再使用设 计的首尾引物进行第三轮PCR扩增，达到双链DNA合成的目的。采用本方法进行的核苷酸合 成以及双链DNA合成与组装，成本低，一次合成的通量高，可以应用于代谢通路，生物途径， 生物元件库或者基因组的组装。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010] 一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，该方法以半导体芯 片合成核苷酸池，用合成的核苷酸池组装成双链DNA，包括以下步骤：
[0011] (1)将预合成的双链DNA分成多个DNA片段；
[0012] ⑵用⑴中获得的DNA片段设计核苷酸；
[0013] (3)以（2)中的核苷酸作为引物，在引物的两端分别加上序列，合成核苷酸序列， 所述核苷酸序列通过半导体芯片制备；
[0014] (4)用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增，获得第一轮PCR产物；
[0015] (5)用至少一种重组酶重组（4)中获得的第一轮PCR产物，得到PCR混合物；
[0016] (6)纯化（5)中的PCR混合物；
[0017] (7)用（6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR，将核苷酸片段进行拼接，获得 拼接后的PCR产物；
[0018] (8)用设计的首尾引物，对（7)中的PCR产物进行第三轮PCR扩增，获得双链DNA 片段。
[0019] 优选地，该方法包括以下步骤：
[0020] (1)将预合成的双链DNA分段成多个200-1000bp的DNA片段；
[0021] (2)用（1)中DNA片段设计核苷酸，每条核苷酸的长度为30-90nt;
[0022] (3)在（2)中设计的30_90nt的核苷酸两端分别加上20nt的flank序列，用Type II或者TypeIIs限制性内切酶识别和酶切序列，合成总长度为80-200nt的核苷酸序列，其 中所述核苷酸序列通过半导体芯片来制备；
[0023] (4)用含有生物素标记的引物扩增，获得第一轮PCR产物；
[0024] (5)用TypeII或者TypeIIs限制性内切酶酶切（4)中获得的第一轮PCR产物；
[0025] (6)用磁珠纯化（5)中酶切后的PCR混合物；
[0026] (7)用（6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR，将核苷酸片段进行拼接；
[0027] (8)用设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增，获得双链DNA片段。
[0028] 优选地，步骤（3)中所述的TypeII或者TypeIIs限制性内切酶用于半导体芯片 高通量合成核苷酸池。
[0029] 优选地，所述TypeII限制性内切酶包括：EcoRI、BamhI、Hindlll;所述TypeIIs 限制性内切酶包括：FokI、Alwl、Bsal、Bbsl、BsmbI。
[0030] 优选地，步骤（5)中所述的TypeII或者TypeIIs限制性内切酶用于以半导体芯 片高通量合成的核苷酸池为原料组装双链DNA。
[0031] 优选地，所述TypeII限制性内切酶包括：EcoRI、BamhI、Hindlll;所述TypeIIs 限制性内切酶包括：FokI、Alwl、Bsal、Bbsl、BsmbI。
[0032] 本发明的有益效果是：
[0033] 其一、采用本发明的方法进行的核苷酸合成以及双链DNA合成与组装，成本低，一 次合成的通量高，可以应用于代谢通路，生物途径，生物元件库或者基因组的组装。
[0034] 其二、本发明的采用半导体芯片高通量合成核苷酸池，每次可以合成上百万条核 苷酸，该方法的成本低，单个碱基的价格可以低到0. 01元/nt。
【附图说明】
[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中 所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图 获得其他的附图。
[0036] 图1半导体芯片高通量合成核苷酸池以及以此为原料组装双链DNA流程图。
【具体实施方式】
[0037] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0038] 实施例1
[0039] 如图1所示，实施例1中公开了一种半导体芯片高通量合成核苷酸池以及用次组 装双链DNA的方法，该方法步骤为：
[0040] (1)将预合成的双链DNA分段成多个200-1000bp的DNA片段。
[0041] (2)用（1)中DNA片段设计核苷酸，每条核苷酸的长度为30-90nt。
[0042] (3)在（2)中设计的30_90nt的核苷酸两端分别加上20nt的flank序列，用Type II或者TypeIIs限制性内切酶识别和酶切序列，合成总长度为80-200nt的核苷酸序列， 其中所述核苷酸通过半导体芯片来制备；在本实施例中，上述TypeII或者TypeIIs限制 性内