切酶用于半导体芯片高通量合成核苷酸池，TypeII限制性内切酶包括但是不限于： EcoRI、BamhI、Hindlll;上述TypeIIs限制性内切酶包括但不限于：FokI、Alwl、Bsal、 Bbsl、BsmbI。
[0043] (4)用含有生物素标记的引物扩增，获得第一轮PCR产物。
[0044] (5)用TypeII或者TypeIIs限制性内切酶酶切（4)中获得的第一轮PCR产物；在 本实施例中，所述的TypeII或者TypeIIs限制性内切酶用于以半导体芯片高通量合成的 核苷酸池为原料组装双链DNA，所述TypeII限制性内切酶包括但是不限于：EcoRI、BamhI、 Hindlll;所述TypeIIs限制性内切酶包括但是不限于：FokI、AlwI、BsaI、BbsI、BsmbI。
[0045] (6)用磁珠纯化（5)中酶切后的PCR混合物。
[0046] (7)用（6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR，将核苷酸片段进行拼接；
[0047] (8)用设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增，获得双链DNA片段。
[0048] 实施例2
[0049] 实施例2中公开了以实施例1中的方法来实际合成双链DNA的实例。
[0050] 实施例2中预合成DNA分成DNA片段（414bp)的序列如下：
[0052] 步骤1 :根据DNA序列设计的引物如表1中所示：
[0053] 表1设计引物表
[0055]
[0056] 步骤2 :在上述的设计的引物两端分别加上20nt的flank序列，和酶切识别位点 序列，本实施例中以TypeIIs限制性内切酶Bsal为例，酶切的正向识别序列为GGTCTC， 酶切的反向识别序列为GAGACC, 5'端的flank序列20nt,序列为TGGTGATAGGTAAGGATGGC; 3'端的flank序列20nt,序列为CGGCTCAGTATTGCGATTAC;合成总长度71-115nt的核苷酸 序列。
[0057] 合成的核苷酸序列如表2中所示：
[0058] 表2合成的核苷酸序列表
[0062] 步骤3 :将步骤2所设计的核苷酸序列通过半导体芯片来制备。
[0063]步骤 4:用含有生物素标记的引物（ATATAGATGCOGTCCTAGCG)和（MGTATCTTTCCTGTGCCCA) 扩增半导体芯片制备的核苷酸池，获得第一轮PCR产物。
[0064] 步骤4中第一轮PCR的反应体系和反应条件如表3和表4所示：
[0065] 表3第一轮PCR反应体系表：
[0066]
[0067]表4第一轮PCR反应条件表：
[0070] 步骤5 :用Bsal酶切步骤4所获得的第一轮PCR产物，获得PCR混合物。
[0071] 步骤6:用磁珠纯化酶切后的第一轮PCR混合物。
[0072] 步骤7 :用纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR，将各段核苷酸拼接起来；此处进 行第二轮PCR的反应体系和反应条件如表5和表6中所示：
[0073] 表5第二轮PCR反应体系表：
[0074]
[0075] 表6第二轮PCR反应条件表：
[0076]
[0077] 步骤8:用设计的首引物：
[0078] GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAA
[0079] 尾引物CTCGAGTGGGGGGCCAG进行第三轮PCR扩增，获得目的双链DNA。在步骤8中 进行第三轮PCR的反应体系和反应条件如表7和表8中所示：
[0080] 表7第三轮PCR反应体系表：
[0081]
[0082] 表8第三轮PCR反应条件表：
[0083]
[0084]本发明中的所有技术和科学术语均按本发明所涉及的行业普通技术人员普遍理 解的正常含义。
[0085]本发明中的"序列"代表着聚合物中单体的排列顺序，比如核苷酸在多核甘酸序列 中的排列顺序，此处所说的"核苷酸序列""核酸"或者"多核苷酸"指的是单链或者双链中 的脱氧核糖核苷酸，核苷酸序列是由自然的核苷酸A，T，C，G，U或者其他合成的自然碱基的 类似物组成，本发明中，腺嘌呤缩写为A，鸟嘌呤缩写为G，胞嘧啶缩写为C，胸腺嘧啶缩写 为T，尿嘧啶缩写为U。多核酸序列可以是单链或者双链，若无特别说明，核苷酸也包括了较 长的核苷酸或较短的核苷酸，比如寡核苷酸。
[0086]本发明中采用传统的标记方法来描述多核苷酸序列，单链和左端为5'端，双链的 左端为正链5'端。
[0087]采用本发明的方法进行的核苷酸合成以及双链DNA合成与组装，成本低，单个碱 基的价格可以低到0.01元/nt;-次合成的通量高，每次可以合成上百万条核苷酸，可以应 用于代谢通路，生物途径，生物元件库或者基因组的组装。
[0088] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，该方法以半导体芯片 合成核苷酸池，用合成的核苷酸池组装成双链DNA，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将欲合成的双链DNA分成多个DNA片段； (2) 用⑴中获得的DNA片段设计核苷酸； (3) 以（2)中的核苷酸作为引物，在引物的两端分别加上序列，合成核苷酸序列，所述 核苷酸序列通过半导体芯片制备； (4) 用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增，获得第一轮PCR产物； (5) 用至少一种重组酶重组（4)中获得的第一轮PCR产物，得到PCR混合物； (6) 纯化（5)中的PCR混合物； (7) 用（6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR，将核苷酸片段进行拼接，获得拼接 后的PCR产物； (8) 用设计的首尾引物，对（7)中的PCR产物进行第三轮PCR扩增，获得双链DNA片段。2. 根据权利要求1所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，其 特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 将欲合成的双链DNA分段成多个200-1000bp的DNA片段； (2) 用（1)中DNA片段设计核苷酸，每条核苷酸的长度为30-90nt; (3) 在（2)中设计的30-90nt的核苷酸两端分别加上20nt的flank序列，用TypeII 或者TypeIIs限制性内切酶识别和酶切序列，合成总长度为80-200nt的核苷酸序列，其中 所述核苷酸序列通过半导体芯片来制备； (4) 用含有生物素标记的引物扩增，获得第一轮PCR产物； (5) 用TypeII或者TypeIIs限制性内切酶酶切（4)中获得的第一轮PCR产物； (6) 用磁珠纯化（5)中酶切后的PCR混合物； (7) 用（6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR，将核苷酸片段进行拼接； (8) 用设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增，获得双链DNA片段。3. 根据权利要求2所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，其 特征在于，步骤（3)中所述的TypeII或者TypeIIs限制性内切酶用于半导体芯片高通量 合成核苷酸池。4. 根据权利要求3所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，其 特征在于，所述TypeII限制性内切酶包括：EcoRI、BamhI、HindIII;所述TypeIIs限制性 内切酶包括：FokI、Alwl、Bsal、Bbsl、BsmbI〇5. 根据权利要求1所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，其 特征在于，步骤（5)中所述的TypeII或者TypeIIs限制性内切酶用于以半导体芯片高通 量合成的核苷酸池为原料组装双链DNA。6. 根据权利要求6所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，其 特征在于，所述TypeII限制性内切酶包括：EcoRI、BamhI、HindIII;所述TypeIIs限制性 内切酶包括：FokI、Alwl、Bsal、Bbsl、BsmbI〇
【专利摘要】本发明涉及半导体芯片高通量合成核苷酸池及组装双链DNA的方法，包括以下步骤：(1)将预合成的双链DNA分成多个DNA片段；(2)用DNA片段设计核苷酸；(3)以核苷酸作为引物，在引物的两端分别加上序列，合成核苷酸序列，核苷酸序列通过半导体芯片制备；(4)用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增；(5)用至少一种重组酶重组第一轮PCR产物；(6)纯化PCR混合物；(7)进行第二轮PCR，将核苷酸片段进行拼接，获得拼接后的PCR产物；(8)用设计的首尾引物，对PCR产物进行第三轮PCR扩增，获得双链DNA片段。本发明的方法成本低，一次合成的通量高。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105274088
【申请号】CN201510744149
【发明人】刁文一, 齐金才, 柳伟强, 孙德斌, 杨平
【申请人】苏州泓迅生物科技有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月5日