表现出提高的通过发酵途径的通量的重组微生物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年6月5日提交的临时申请号61/831，591的优先权，该临时申 请的内容在此以引用的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及通过优化酶促反应来提高通过发酵途径的通量的方法。更具体地说， 本发明涉及鉴定和解决发酵途径中的反应瓶颈。
【背景技术】
[0004] 产乙酸型微生物已知可用于通过使包括例如一氧化碳、二氧化碳以及氢气在内的 基质发酵来产生燃料和其它化学品（例如乙醇、丁醇或丁二醇）。
[0005] 迄今为止用于提高产物浓度和基质利用率的努力集中在菌株选择、发酵条件和参 数的优化以及培养基配方或工艺条件的优化（Abubackar等，2012)。然而，天然生物体的代 谢没有进化到实现高收率、速率以及滴度的商业目标（Nielsen，2011)。虽然在生物体中某 些反应的速率可以通过优化工艺条件或菌株的选择来提高，但是通常存在不受影响并且将 是限速的一些反应。
[0006] 在过去十年中，已经研发出许多硅片上预测工具以研究基因组规模的代谢重建。 这些基于约束条件的模型使用化学计量方法来研究通过代谢网络的通量，其中所有可能的 净通量分布（可行的通量空间）均由所观测到的细胞输入和输出测量结果（外部通量）以 及质量平衡和热力学方程的约束。通量平衡分析（FBA)探测这一解空间以鉴定优化某些目 标（通常是使生长达到最大限度）的代谢通量分布。通量平衡分析需要非常少的关于系统 中的酶动力学参数和代谢物浓度的信息。然而，这种方法的一个限制因素在于它不能鉴定 限速反应（瓶颈）。
[0007] 本发明的目的在于提供一种提高发酵反应的效率的方法，或至少为公众提供一个 有用的选择。
【发明内容】
[0008] 在第一个方面，本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下 步骤：
[0009]a)确定发酵途径中的限速途径反应；
[0010]b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0011] c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属（Clostridia)微生物使包含C0的基质发酵， 所述微生物被适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种 或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅 因子的利用率提高，以产生发酵产物。
[0012] 在第二个方面，本发明提供了一种提高通过发酵途径的通量的方法，所述方法至 少包括以下步骤：
[0013]a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；
[0014] b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0015] c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含C0的基质发酵，所述微生物被 适配成在与亲本微生物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其 任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率 提尚。
[0016] 在第三个方面，本发明提供了一种产生重组一氧化碳营养型梭菌属微生物的方 法，所述微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高的通过发酵途径的通量，所述方法 包括：
[0017]a)确定所述发酵途径中的限速途径反应；
[0018] b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0019] c)使亲本微生物转化以产生重组微生物，所述重组微生物被适配成在与亲本微生 物相比时表现出以下各项中的至少一项：i)b)的一种或多种酶或其任何一种或多种的功 能上等同的变体的活性提尚；或ii)b)的一种或多种辅因子的利用率提尚；
[0020] 其中所述发酵途径能够由包含C0的基质产生一种或多种发酵产物。
[0021] 在第四个方面，本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法包括使用重组 一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含C0的基质发酵以产生发酵产物，其中所述重组微生 物被适配成表现出以下各项中的至少一项：
[0022] i)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的一种或 多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变体的活性提高；或
[0023]ii)在与亲本微生物相比时，被鉴定为参与催化发酵途径的限速途径反应的一种 或多种辅因子的利用率提高。
[0024] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成：
[0025] i)过表达被鉴定为参与催化限速途径反应的一种或多种酶或其任何一种或多种 的功能上等同的变体；或
[0026] ii)表达被鉴定为参与催化限速途径反应的一种或多种外源性酶；或
[0027] iii)i)和ii)这两者。
[0028] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物已经经受酶工程 化以提高酶的活性或提高一种或多种辅因子的利用率，所述酶和所述一种或多种辅因子被 鉴定为参与催化限速途径反应。在一个具体的实施方案中，酶工程化的方法选自由以下各 项组成的组：定向进化、基于知识的设计、随机诱变法、基因改组、密码子优化、使用位点特 异性文库以及使用位点评价文库。
[0029] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成相对于 亲本微生物表现出所述发酵途径的效率的提高。优选地，所述效率提高包括发酵产物的产 生速率的提尚。
[0030] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，通过分析构成发酵途径的两种或 更多种途径反应的酶活性来确定所述限速途径反应。
[0031] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述限速途径反应是具有最低的 酶活性的途径反应。
[0032] 在第一个方面、第三个方面或第四个方面的一个具体的实施方案中，所述一种或 多种发酵产物是乙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、高级醇、丁二醇、2, 3-丁二醇、丁二酸盐、类异 戊二烯、脂肪酸或生物聚合物中的至少一种。
[0033] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述发酵途径是伍德-扬达尔 (Wood-Ljungdahl)发酵途径、乙醇发酵途径或2, 3- 丁二醇发酵途径。
[0034] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各 项组成的组：醇脱氢酶（EC1. 1. 1. 1)、醛脱氢酶（酰化）（EC1. 2. 1. 10)、甲酸脱氢酶（EC 1. 2. 1. 2)、甲酰基-THF合成酶（EC6. 3. 2. 17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水 解酶（EC:6. 3. 4. 3)、亚甲基-THF还原酶（EC1. 1，1. 58)、C0脱氢酶/乙酰辅酶A合酶（EC 2. 3. 1. 169)、醛铁氧还蛋白氧化还原酶（EC1. 2. 7. 5)、磷酸转乙酰酶（EC2. 3. 1. 8)、乙酸 激酶（EC2. 7. 2. 1)、C0脱氢酶（EC1. 2. 99. 2)、以及氢化酶（EC1. 12. 7. 2)。优选地，这个 实施方案的微生物被适配成表现出通过引起乙醇产生的发酵途径的通量提高。
[0035] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各 项组成的组：丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（丙酮酸合酶）（EC1. 2. 7. 1)、丙酮酸：甲 酸裂解酶（EC2. 3. 1. 54)、乙酰乳酸合酶（EC2. 2. 1. 6)、乙酰乳酸脱羧酶（EC4. 1. 1. 5)、 2, 3-丁二醇脱氢酶（EC1. 1. 1.4)、伯醇：仲醇脱氢酶（EC1. 1. 1. 1)、甲酸脱氢酶（EC 1. 2. 1. 2)、甲酰基-THF合成酶（EC6. 3. 2. 17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水 解酶（EC:6. 3. 4. 3)、亚甲基-THF还原酶（EC1. 1，1. 58)、C0脱氢酶/乙酰辅酶A合酶（EC 2. 3. 1. 169)、C0脱氢酶（EC1. 2. 99. 2)、以及氢化酶（EC1. 12. 7. 2)。优选地，这个实施方 案的微生物被适配成表现出通过引起2, 3- 丁二醇产生的发酵途径的通量提高。
[0036] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成表达外 源性核酸或过表达内源性核酸，所述核酸涉及参与催化限速途径反应的酶或辅因子的生物 合成。在一个具体的实施方案中，所述内源性核酸或外源性核酸编码选自上述酶的酶。
[0037] 在前述方面中任一个的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成表现出 一种或多种辅因子的利用率提高。所述利用率提高可以由于内源性核酸的表达发生改变或 外源性核酸的表达而出现，其中所述内源性核酸或外源性核酸涉及参与催化限速途径反应 的辅因子的生物合成。
[0038] 在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括四氢叶酸盐（THF)。在一个具体的实施 方案中，所述重组微生物表现出以下各项中的至少一种的表达增加：GTP环化水解酶I(EC 3. 5. 4. 16)、碱性磷酸酶（EC3. 1. 3. 1)、二氢新蝶呤醛缩酶（EC4. 1. 2. 25)、2-氨基-4-羟 基-6-羟基甲基二氢蝶啶二磷酸激酶（EC2. 7.6. 3)、二氢蝶酸合酶（2.5. 1. 15)、二氢蝶 酸合酶（EC2. 5. 1. 15)、二氢叶酸合酶（EC6. 3. 2. 12)、叶酰聚谷氨酸合酶（6. 3. 2. 17)、 二氢叶酸还原酶（EC1.5. 1.3)、胸苷酸合酶（EC2. 1.1.45)、或二氢单蝶呤还原酶 (dihydromonapterinreductase)(ECL5.L-)〇
[0039] 在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括钴胺素（B12)。在一个具体的实施 方案中，所述重组微生物表现出以下各项中的至少一种的表达增加：5_氨基乙酰丙酸合 酶（EC2. 3. 1.37)、5_氨基乙酰丙酸：丙酮酸转氨酶（EC2.6. 1.43)、腺苷钴啉醇酰胺 激酶/腺苷钴啉醇酰胺-磷酸鸟苷酰基转移酶（EC2. 7. 1. 156/2. 7. 7. 62)、腺苷钴啉醇 酰胺-GDP核唑转移酶（EC2. 7. 8. 26)、腺苷钴啉醇酰胺-磷酸合酶（EC6. 3. 1. 10)、腺 苷钴啉胺酸合酶（EC6. 3.5. 10)、α-核唑磷酸酶（EC3. 1.3. 73)、钴⑴胺素腺苷转 移酶（EC2. 5. 1. 17)、钴（II)啉酸a,c-二酰胺还原酶（EC1. 16. 8. 1)、钴-前咕啉5Α 水解酶（EC3.7. 1. 12)、钴-前咕啉-5B(C1)_甲基转移酶（EC2. 1. 1. 195)、钴-前咕 啉-7(C15)_ 甲基转移酶（EC2. 1. 1. 196)、钴螯合酶CobN(EC6. 6. 1. 2)、钴啉酸a,c-二 酰胺合酶（EC6. 3. 5.9/6. 3. 5. 11)、铁蛋白（EC1.16. 3.1)、谷氨酸-1-半醛2，1_氨基变 位酶（EC5. 4. 3. 8)、谷氨酰基-tRNA还原酶（EC1. 2. 1. 70)、谷氨酰基-tRNA合成酶（EC 6. 1. 1. 17)、羟基甲基胆素合酶（EC2. 5. 1. 61)、烟酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖 基转移酶（EC2. 4. 2. 21)、非氧依赖性粪卟啉原III氧化酶（EC1. 3. 99. 22)、胆色素原合 酶（EC4. 2. 1. 24)、前咕啉-2脱氢酶/西罗叶绿三酸（sirohydrochlorin)亚铁螯合酶（EC 1. 3. 1. 76/4. 99. 1. 4)、前咕啉-2/ 钴因子-2C20-甲基转移酶（EC2. 1. 1. 130/2. 1. 1. 151)、 前咕啉-3B合酶（EC1. 14. 13. 83)、前咕啉-3BC17-甲基转移酶（EC2. 1. 1. 131)、前咕 啉-4C11-甲基转移酶（EC2. 1. 1. 133)、前咕啉-6X还原酶（EC1.3. 1.54)、前咕啉-6Y C5, 15-甲基转移酶（EC2. 1. 1. 132)、前咕啉-8W脱羧酶（EC1.、前咕啉-8X甲 基变位酶（EC5.4. 1.2)、西罗叶绿三酸钴螯合酶（EC4.99. 1.3)、苏氨酸-磷酸脱羧酶 (EC4. 1. 1. 81)、尿卟啉原脱羧酶（EC4. 1. 1. 37)、或尿卟啉原III甲基转移酶/合酶（EC 2. 1. 1. 107/4. 2. 1. 75) 〇
[0040] 在第五个方面，本发明提供了一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生 物是通过第三个方面的方法所产生的。
[0041] 在第六个方面，本发明提供了一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生 物被适配成表现出以下各项中的至少一项：
[0042]a)在与亲本微生物相比时，一种或多种酶或其任何一种或多种的功能上等同的变 体的活性提尚；
[0043]b)在与亲本微生物相比时，一种或多种辅因子的利用率提高；或
[0044]c)a)和b)这两者；
[0045] 其中所述酶或辅因子已经被鉴定为参与催化限速途径反应。
[0046] 在第七个方面，本发明提供了根据第五个方面或第六个方面的微生物用于提高通 过反应途径的通量的用途。
[0047] 在第八个方面，本发明提供了一种产生发酵产物的方法，所述方法至少包括以下 步骤：
[0048]a)确定伍德-扬达尔发酵途径、乙醇发酵途径或2, 3-丁二醇发酵途径中的限速途 径反应；
[0049]b)鉴定参与催化所述限速途径反应的一种或多种酶、辅因子或这两者；
[0050]c)使用重组一氧化碳营养型梭菌属微生物使包含C0的基质发酵，所述微生物被 适配成在与亲本微生物相比时表达或过表达编码b)的一种或多种酶或辅因子的基因或其 功能上等同的变体，以产生发酵产物。
[0051] 在一个具体的实施方案中，第八个方面的酶是A0R1并且所述发酵产物是乙醇。
[0052]本发明还可以被宽泛地认为在于在本申请的说明书中单独或共同提及或指示的 部分、元件以及特征、所述部分、元件或特征中两种或更多种的任何或所有组合，并且在本 文提到具体的整体方案并且所述整体方案在与本发明相关的领域中具有已知的等同方案 的情况下，这些已知的等同方案被认为并入到本文中，如同单独地阐述这些已知的等同方 案一般。
【附图说明】
[0053]现在将参考附图仅以举例的方式对本发明的实施方案进行描述，其中：
[0054] 图1示出了乙醇生物合成途径的通量图，该通量图详述了所测量的通过一氧化碳 营养型细胞经由乙酰辅酶A形成乙醇的酶活性和通量，这允许鉴定限速途径反应。箭头的 厚度与特定的途径反应的活性成比例；以及
[0055] 图2示出了通量图，所述通量图详述了所测量的通过一氧化碳营养型细胞经由丙 酮酸盐形成2, 3- 丁二醇的酶活性和通量，这允许鉴定限速途径反应。
[0056] 图3示出了表达质粒PMTL83157-A0R1A0R1的插入序列和启动子的序列比对，确认 A0R1的两个内部Ndel位点被成功地改变并且它们不含突变。
[0057] 图4示出了在质粒对照和A0R1过表达菌株这两者中预期的576bp产物的存在，这 说明成功的转化以产生重组微生物。
[0058] 图5示出了在对来自pMTL83157-A0Rl转化体的所拯救的质粒进行Ndel和ΚρηΙ 消化之后预期片段的存在。
[0059] 图6示出了相对于质粒对照，A0R1的过表达（十字形，在第10天时处于上方的线） 提高了自产乙醇梭菌（C.autoethanogenum)DSM10061的自养生长。
[0060] 图7A示出了相比于具有A0R1过表达的自产乙醇梭菌重组菌株（正方形，在第10 天时处于上方的线），自产乙醇梭菌野生型菌株（十字形，在第10天时处于下方的线）中乙 醇的产生。
[0061] 图7B示出了相比于具有A0R1过表达的自产乙醇梭菌重组菌株（正方形，在第10 天时处于上方的线），自产乙醇梭菌野生型菌株（十字形，在第10天时处于下方的线）中乙 酸盐的产生。
【具体实施方式】
[0062] 定义
[0063] 如本文所提到的"发酵途径"是使基质，优选地气体基质转化成发酵产物的生物化 学反应（在本文中被称为"途径反应"）的级联。所述途径反应通常涉及酶并且可能涉及辅 因子，其中所述酶或辅因子促进或提高所述途径反应的速率。
[0064] 如本文所提到的"限速途径反应"是如下的反应，所述反应是发酵途径的一部分， 并且是所述途径中的"瓶颈"，因此，通过所述整个途径的通量被减慢并且由所述限速途径 反应的反应速率决定。在所有其它因素恒定的情况下，提高所述限速途径反应的反应速率 对总体发酵途径的速率以及潜在的一种或多种发酵产物的产生具有连锁作用。在本文提到 "一种"或"所述"（单数）限速途径反应的情况下，应当了解的是，多种（例如2种或更多 种）限速途径反应也被包括在本发明的范围内并且这样的多种反应也可以根据本文所述 的方法来确定和改变。
[0065] 如本文所提到的反应"通量"指的是代谢物通过发酵途径中的一种或多种反应的 流量。通过单独的途径反应的通量具有上限和下限，因此可以通过调整影响酶活性的条件 或因素来使通量发生变化。调整通过一种途径反应的通量可以改变发酵途径的总通量。可 以根据本领域技术人员已知的方法来测量通量。举例来说，可以使用通量平衡分析（FBA) 来测量通量（Gianchandani等，2010)。在一个具体的实施方案中，使所述通量提高了至少 5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少100%。还可以通过代谢物和产物 的水平（代谢组学）（Patti等，2012)和/或标记实验（如C13)(通量组学）（Niittylae 等，2009 ;Tang等，2009)来测量通过所述途径的通量。
[0066] 术语"烟酰胺腺嘌呤二核苷酸"(NADH)指的是NAD+(氧化形式）、NADH+H+(还原形 式）或NAD+和NADH+H+这两者的氧化还原电对。
[0067] 术语"烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸"（NADPH)指的是NADP+ (氧化形式）、 NADPH+H+ (还原形式）或NADP+和NADPH+H+这两者的氧化还原电对。
[0068] 如本文所提到的"酶辅因子"或简称"辅因子"是与酶结合以促进所述酶的生物功 能并且因此促进反应催化的非蛋白化合物。辅因子的非限制性实例包括NAD+、NADP+、钴胺 素、四氢叶酸盐以及铁氧还蛋白。辅因子的总利用率的提高可以提高途径反应的速率。可 以影响辅因子的产生的因素包括辅因子生物合成基因的表达，所述表达可以被改变以实现 所述辅因子的利用率的提高。还可以使用本领域技术人员已知的其它因素来实现所述辅因 子的利用率的提高。缺乏对辅因子的利用