. 2. 1. 10)、甲酸脱氢酶（EC1. 2. 1. 2)、 甲酰基-THF合成酶（EC6. 3. 2. 17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶 出(：:6.3.4.3)、亚甲基-1'册还原酶伍(：1.1，1.58)、0)脱氢酶/乙酰辅酶4合酶伍〇 2. 3. 1. 169)、醛铁氧还蛋白氧化还原酶（EC1. 2. 7. 5)、磷酸转乙酰酶（EC2. 3. 1. 8)、乙酸 激酶（EC2. 7. 2. 1)、C0脱氢酶（EC1. 2. 99. 2)、以及氢化酶（EC1. 12. 7. 2)。优选地，这个 实施方案的微生物被适配成表现出通过引起乙醇产生的发酵途径的通量提高。
[0127] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述一种或多种酶选自由以下各项组成的 组：丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（丙酮酸合酶）（EC1. 2. 7. 1)、丙酮酸：甲酸裂解酶(EC2. 3. 1. 54)、乙酰乳酸合酶（EC2. 2. 1. 6)、乙酰乳酸脱羧酶（EC4. 1. 1. 5)、2, 3- 丁二 醇脱氢酶（EC1. 1. 1. 4)、伯醇：仲醇脱氢酶（EC1. 1. 1. 1)、甲酸脱氢酶（EC1. 2. 1. 2)、 甲酰基-THF合成酶（EC6. 3. 2. 17)、亚甲基-THF脱氢酶/甲酰基-THF环化水解酶 出(：:6.3.4.3)、亚甲基-1'册还原酶伍(：1.1，1.58)、0)脱氢酶/乙酰辅酶4合酶伍〇 2. 3. 1. 169)、C0脱氢酶（EC1. 2. 99. 2)、以及氢化酶（EC1. 12. 7. 2)。优选地，这个实施方 案的微生物被适配成表现出通过引起2, 3- 丁二醇产生的发酵途径的通量提高。
[0128] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述重组微生物被适配成表达外源性核酸或 过表达内源性核酸，其中所述核酸编码酶或其功能上等同的变体，或涉及辅因子的生物合 成，其中所述酶或辅因子参与催化限速途径反应。
[0129] 产生用于本发明中的重组微生物的方法描述于下文中。
[0130] 编码上文所述的酶的核酸将是本领域技术人员已知的并且可以容易地使用基因 信息数据库，如NCBI、KEGG、UniProt来鉴定。
[0131] 本申请的发明人还已经惊人地发现提高辅因子利用率对通过发酵途径的总通量 有影响。在这些情况下，发酵途径或这种发酵途径内的反应依赖于某种辅因子并且可能受 该辅因子的利用率限制。可供用于反应中的辅因子的池可以通过改变涉及这种辅因子的生 物合成途径的蛋白质和基因的表达来增加。由于辅因子利用率提高，因此依赖于这种辅因 子的反应不再受到限制。
[0132] 在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括四氢叶酸盐。如上文所指出，可以使 参与这种辅因子的生物合成的酶过表达，优选地通过使编码所述酶的相应基因表达或过 表达来实现。参与四氢叶酸盐的生物合成的酶详述于下文中。因此，在一个具体的实施 方案中，所述重组微生物表现出以下各项的表达增加：GTP环化水解酶I(EC3. 5. 4. 16)、 碱性磷酸酶（EC3. 1. 3. 1)、二氢新蝶呤醛缩酶（EC4. 1. 2. 25)、2-氨基-4-羟基-6-羟基 甲基二氢蝶啶二磷酸激酶（EC2. 7. 6. 3)、二氢蝶酸合酶（2. 5. 1. 15)、二氢蝶酸合酶（EC 2. 5. 1. 15)、二氢叶酸合酶（EC6. 3. 2. 12)、叶酰聚谷氨酸合酶（6. 3. 2. 17)、二氢叶酸还原 酶（EC1. 5. 1. 3)、胸苷酸合酶（EC2. 1. 1. 45)、二氢单蝶呤还原酶（EC1. 5. 1.-)。所有均涉 及thf。
[0133] 在一个具体的实施方案中，所述辅因子包括钴胺素（B12)。参与钴胺素的生物 合成的酶详述于下文中。因此，在一个具体的实施方案中，所述重组微生物表现出以下 各项的表达增加：5_氨基乙酰丙酸合酶（EC2. 3. 1.37)、5_氨基乙酰丙酸：丙酮酸转 氨酶（EC2. 6. 1. 43)、腺苷钴啉醇酰胺激酶/腺苷钴啉醇酰胺-磷酸鸟苷酰基转移酶 (EC2. 7. 1. 156/2. 7. 7. 62)、腺苷钴啉醇酰胺-GDP核唑转移酶（EC2. 7. 8. 26)、腺苷钴 啉醇酰胺-磷酸合酶（EC6.3. 1. 10)、腺苷钴啉胺酸合酶（EC6.3. 5. 10)、α-核唑磷酸 酶（EC3. 1. 3. 73)、钴（I)胺素腺苷转移酶（EC2. 5. 1. 17)、钴（II)啉酸a,c-二酰胺还 原酶（EC1. 16. 8. 1)、钴-前咕啉5A水解酶（EC3. 7. 1. 12)、钴-前咕啉-5B(C1)-甲 基转移酶（EC2. 1.1. 195)、钴-前咕啉-7 (C15)-甲基转移酶（EC2. 1.1. 196)、钴螯合 酶CobN(EC6. 6. 1. 2)、钴啉酸a,c-二酰胺合酶（EC6. 3. 5. 9/6. 3. 5. 11)、铁蛋白（EC 1. 16. 3. 1)、谷氨酸-1-半醛2, 1-氨基变位酶（EC5. 4. 3. 8)、谷氨酰基-tRNA还原酶（EC 1. 2. 1. 70)、谷氨酰基-tRNA合成酶（EC6. 1. 1. 17)、羟基甲基胆素合酶（EC2. 5. 1. 61)、 烟酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖基转移酶（EC2. 4. 2. 21)、非氧依赖性粪卟啉 原III氧化酶（EC1. 3. 99. 22)、胆色素原合酶（EC4. 2. 1. 24)、前咕啉-2脱氢酶/西罗 叶绿三酸亚铁螯合酶（EC1.3. 1.76/4. 99. 1.4)、前咕啉-2/钴因子-2C20-甲基转移酶 伍〇2.1.1.130/2.1.1.151)、前咕啉-38合酶伍(：1.14.13.83)、前咕啉-38(：17-甲基 转移酶（EC2. 1. 1. 131)、前咕啉-4C11-甲基转移酶（EC2. 1. 1. 133)、前咕啉-6X还原酶 (EC1. 3. 1. 54)、前咕啉-6YC5, 15-甲基转移酶（EC2. 1. 1. 132)、前咕啉-8W脱羧酶（EC 1.前咕啉-8X甲基变位酶（EC5. 4. 1. 2)、西罗叶绿三酸钴螯合酶（EC4. 99. 1. 3)、 苏氨酸-磷酸脱羧酶（EC4. 1. 1. 81)、尿卟啉原脱羧酶（EC4. 1. 1. 37)、尿卟啉原III甲基 转移酶 / 合酶（EC2.LL107/4. 2.L75)。
[0134] 编码上述蛋白质的生物合成基因将是本领域技术人员已知的或可以容易地使用 基因信息数据库来鉴定。
[0135] 不希望受理论所束缚，认为辅因子的利用率的提高是经由参与所述辅因子的生物 合成途径的酶或基因的过表达来实现的。因此，依赖于这种辅因子的反应不再具有限制性。
[0136] 对酶进行修饰以实现更高的活性
[0137] 在本发明的一个具体的实施方案中，重组微生物已经经受酶工程化以提高能够催 化限速途径反应的酶的酶活性。酶工程化可以包括本领域技术人员已知的任何遗传修饰， 包括但不限于一个或多个核苷酸的缺失、插入以及取代。实现提高的酶活性的合适的方法 将是本领域技术人员已知的，但是举例来说，酶工程化的方法可以选自由以下各项组成的 组：定向进化、基于知识的设计、随机诱变法、基因改组、密码子优化、使用位点特异性文库 以及使用位点评价文库。
[0138] 重组微生物
[0139] 在另一个方面，本发明提供了一种重组一氧化碳营养型梭菌属微生物，所述微生 物由如上文所述的方法产生，其中所述重组微生物被适配成相对于亲本微生物表现出提高 的通过发酵途径的通量。
[0140] 在具体实施方案中，酶的表达提高和/或辅因子的利用率提高是通过编码所述酶 或涉及所述辅因子的生物合成的核酸的表达和/或过表达来实现的。
[0141] 在另一个方面，本发明提供了本发明的微生物用于提高通过反应途径的通量的用 途。
[0142] 在本发明的一个具体的实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养型梭菌 的组，该组包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌（Clostridiumragsdalei)、食一氧 化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridiumdrakei)、奠味梭 菌（Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌（Clostridiumaceticum)、甲酸乙酸梭菌 (Clostridiumformicoaceticum)、马氏梭菌（Clostridiummagnum)。
[0143] 在一个实施方案中，所述微生物选自一群一氧化碳营养型梭菌，包括菌种自 产乙醇梭菌、杨氏梭菌和"拉氏梭菌"以及相关的分离株。这些包括但不限于菌株自 产乙醇梭菌JAI-1T (DSM10061)(Abrini等，1994)、自产乙醇梭菌LBS1560 (DSM19630) (W0/2009/064200)、自产乙醇梭菌、杨氏梭菌PETCT (DSM13528 =ATCC55383)(Tanner 等，1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC55380)(美国专利 5, 593, 886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利 6, 368, 819)、杨氏梭菌 0-52(ATCC55989)(美国专利 6, 368, 819)、 或"拉氏梭菌PI1T"（ATCCBAA-622)(WO2008/028055)、以及相关的分离株，如"科斯卡 塔梭菌（C.coskatii)"（美国专利2011/0229947)或"梭菌属菌种MT351"（Tyurin和 Kiriukhin, 2012)、以及其突变株，如杨氏梭菌OTA-1 (Tirado-Acevedo0.，使用杨氏梭 菌由合成气产生生物乙醇（ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsing Clostridiumljungdahlii)，北卡罗莱纳州立大学的博 士论文（PhDthesis,North CarolinaStateUniversity)，2010)〇
[0144] 这些菌株形成了梭菌rRNA集群I(ClostridialrRNAclusterI)内的一个子集 群（Collins等，1994)，在16SrRNA基因水平上具有至少99%同一性，尽管仍是独特的菌 种，如由DNA-DNA复性和DNA指纹图谱实验（W0 2008/028055、美国专利2011/0229947)所 确定。
[0145] 这个集群中的菌株由共同的特征限定，即具有相似的基因型和表型这两者，并且 它们都共有相同的能量保存和发酵代谢的模式。这个集群中的菌株缺少细胞色素并且经由 Rnf复合体来保存能量。
[0146] 这个集群中的所有菌株均具有约4. 2MBp的基因组尺寸（KSpke等，2010)以 及约 32 摩尔 ％ 的GC组成（Tanner等，1993;Abrini等，1994;Kopke等，2010)(TO 2008/028055 ;美国专利2011/0229947)，以及编码以下酶的保守的必要的关键基因操纵 子：伍德-扬达尔途径的酶（一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶 酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶、以及一氧化碳脱氢酶 /乙酰辅酶A合酶）、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体（rnfCDGEAB)、丙酮酸：铁氧还蛋白氧 化还原酶、醛：铁氧还蛋白氧化还原酶（Kdpke等，2010,2011)。已经发现在所有菌种中 负责气体吸收的伍德-扬达尔途径基因的组织和数量是相同的，尽管在核酸序列和氨基酸 序列方面存在差异（Kiipke等，2011)。
[0147] 这些菌株均具有相似的形态和尺寸（对数生长期的细胞是0.5-0. 7X3-5μm)， 是嗜温的（最佳生长温度是30°C-37°C)并且是严格厌氧菌（Tanner等，1993;Abrini 等，1994) (W0 2008/028055)。此外，它们均共有相同的主要系统发育性状，如相同的pH值 范围（pH4-7. 5,最佳的初始pH值是5. 5-6)、以相似的生长速率依赖含C0的气体进行强 自养生长、以及代谢谱，其中乙醇和乙酸是主要的发酵最终产物，在一定条件下形成少量的 2, 3- 丁二醇和乳酸（Tanner等，1993;Abrini等，1994 ;K8pke等，2011) (W0 在对各种糖 (例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡糖酸盐、柠檬酸盐）、氨基酸（例如精氨酸、组氨酸）、 或其它基质（例如甜菜碱、丁醇）的基质利用率方面有所不同。发现这些菌种中的一些对 某些维生素（例如硫胺素、生物素）是营养缺陷型菌种，而其它则不是。已经证实在这些生 物体中的多种生物体中将羧酸还原成它们相应的醇（Perez等，2012)。
[0148]因此，所述的性状并非是如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一种生物体所特有的，而 是合成乙醇的一氧化碳营养型梭菌的一般性状。因此，预期本发明可以跨越这些菌株起作 用，尽管在性能方面可能存在差异。
[0149] 在某些实施方案中，亲本微生物选自包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌以及拉氏梭菌 的组。在一个实施方案中，该组还包括科斯卡塔梭菌。在一个具体的实施方案中，所述亲本 微生物是自产乙醇梭菌。
[0150] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物被适配成表 达酶或提高辅因子的利用率，其中所述酶的表达或辅因子的利用率取决于核酸的表达。所 述重组微生物还可以表达被适配成使得酶的表达和/或辅因子的利用率提高的核酸构建 体或载体。在一个具体的实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而其 它构建体和载体，如用于克隆的那些构建体和载体也由本发明所涵盖。在一个具体的实施 方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
[0151] 应当了解的是，除了启动子之外，本发明的表达构建体/载体还可以含有多种调 节元件并且如果需要的话，还可以含有适用于表达另外的蛋白质的另外的基因。在一个实 施方案中，所述表达构建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，所述表达构建体 /载体包括两个或更多个启动子。在一个具体的实施方案中，所述表达构建体/载体包括一 个用于所欲表达的每一种基因的启动子。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括 一个或多个核糖体结合位点，优选地用于所欲表达的每一种基因的核糖体结合位点。
[0152] 本领域技术人员应当了解的是，本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可以含 有标准的接头核苷酸，如核糖体结合位点和/或限制性酶切位点所需的那些接头核苷酸。 这些接头序列不应当被解释为是必要的并且不对所限定的序列构成限制。
[0153] 本发明的核酸和核酸构建体（包括表达构建体/载体）可以使用本领域中的 许多标准技术来构建。举例来说，可以使用化学合成或重组技术。这些技术描述于例如 Sambrook等（《分子克隆：实验室手册》（MolecularCloning:Alaboratorymanual),纽 约州冷泉港的冷泉港实验室出版社（ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor,NY) ,1989)中。基本上，单个基因和调节元件将彼此可操作地连接以使得这些基因 可以被表达以形成所需的蛋白质。用于本发明中的合适的载体将由本领域的普通技术人员 所了解。然而，举例来说，以下载体可以是合适的：pMTL80000载体、pniPl、pJIR750以及本 文在下文的实施例部分中所举例说明的质粒。
[0154] 应当了解的是，如本文所述的核酸可以呈任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
[0155] 产生重组微生物的方法
[0156] 对亲本微生物进行遗传修饰的方法包括分子方法，如异源基因表达、基因组插入 或缺失、改变的基因表达或基因的失活、或如本文所述的酶工程化方法。这些技术描述于例 如Sambrook等（《分子克隆：实验室手册》（MolecularCloning:Alaboratorymanual), 纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社，2001)、Pleiss(2011)、Park，S.和Crochan，J. R. (2010，《蛋白质工程化和设计》（Proteinengineeringanddesign),CRC出版社（CRC Press),ISBN1420076582)中。
[0157] -种或多种外源性核酸可以裸核酸形式被递送到亲本微生物中或可以使用一种 或多种试剂配制以促进转化过程（例如与脂质体缀合的核酸、含有所述核酸的生物体）。所 述一种或多种核酸在适当时可以是DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中，可以使用限制 性内切酶抑制剂；参见例如Murray,Ν·E.等（2000)Microbial.Molec.Biol.Rev. 64, 412。
[0158] 本发明的微生物可以使用本领域已知用于产生重组微生物的多种技术用亲本微 生物和一种或多种外源性核酸来制备。仅举例来说，可以通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇 介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或缀合来实现转化（包括转 导或转染）。合适的转化技术描述于例如SambrookJ，FritschEF，ManiatisT:《分子克 隆：实验室手册》（Molecular Cloning:A laboratory Manual),冷泉港的冷泉港实验室出 版社，1989中。
[0159] 电穿孔已经被描述用于多种一氧化碳营养型产乙酸菌，如杨氏梭菌（iCIipke 等，2010, Poe. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 107:13087-92 ; (Leang等，2011) PCT/NZ2011/000203 ; W02012/053905)、自产乙醇梭菌（PCT/NZ2011/000203 ;TO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌 (Acetobacterium woodii) (Straetz等，1994,Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37)或 热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica) (Kita等，2012)，并且是用于许多梭菌的标准 方法，如丙酮丁醇梭菌（Mermelstein等，1992, Biotechnology, 10, 190-195)、解纤维素梭 菌（C. cellulolyticum) (Jennert等，2000, Microbiology, 146:3071-3080)或热纤梭菌 (C. thermocellum) (Tyurin等，2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:883-890)。原菌体 诱导已被证实用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及奠味梭菌的情况下（Prasanna Tamarapu Parthasarathy，2010,在粪味梭菌ATCC 25775中用于产生突变株的遗传修饰系统的研 发（Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775for