重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺。
【背景技术】
[0002]农药在农林作物病虫草害防治过程中得以广泛使用，对农业增产有着非常重要的作用，但在一定时期内农作物上会有部分农药残留，如果长时间摄食残留农药的农作物，会对人体健康造成影响。农药是通过抑制昆虫中枢神经中的胆碱酯酶使之死亡而发挥杀虫作用的，同时对人体内的胆碱酯酶也有抑制作用，能阻断神经递质的传递，达到一定量后会引起肌肉麻痹，造成中毒、致癌、致畸、致突变等危害。近年来，随着农药残留研究的不断深入，农药残留的检测方法也日趋完善，并向简单、快速、灵敏、多残留检测、低成本、易推广的方向发展。用于残留农药检测的酶有羧酸酯酶、丁酰胆碱酯酶及乙酰胆碱酯酶，前两种酶检测时受干扰因素多，假阳性率高，专一性低。乙酰胆碱酯酶(Acetycholinesterase, AChE)是存在于中枢神经系统内的一种水解酶，经典作用是水解神经递质乙酰胆碱(ACh)，终止神经冲动的传导。由于常见的残留农药主要是有机磷和氨基甲酸酯类药剂，通过抑制昆虫中枢神经中的胆碱酯酶而使之死亡。因此，AChE作为此类农药的最适反应底物，在农药残留的快速检测中得到了广泛应用，尤其是基于AChE的生物传感器已成为农残检测研究中的热点。
[0003]由于AChE主要是从昆虫或动物血液中提取，产量低，成本高、灵敏度变化幅度大，严重阻碍了 AChE在农药残留检测中的应用。随着基因工程技术的发展，可以通过克隆AChE基因，使其在外源表达系统中高效表达。研究发现，AChE不适于原核表达，表达后无生物学活性，但利用真核表达系统(如酵母、昆虫等)则可以保持其完好的生物学活性。
[0004]毕赤酵母(PichiaPastoris)为单细胞真核生物，生长快、易于分子遗传学操作；毕赤酵母的醇氧化酶(Α0ΧΙ)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋自，并且由于毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，更有利于后期纯化；同时外源基因不是存在于自主复制的质粒中，而是和表达载体一起整合到了酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象。由于该表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白。但时至今日，在酵母表达系统中对乙酰胆碱酯酶进行大规模发酵表达却未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺，该工艺操作简单，蛋白表达成本低且表达量高、酶活性高。
[0006]为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案: 本发明所述的重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺为:
首先将活化保存的重组毕赤酵母菌株进行培养，制得发酵工作种子液，然后将该发酵工作种子液按一定的接种量转接到基础盐培养基中，调整发酵罐温度29°C，罐压0.06 MPa,转速600rpm，利用氨水或磷酸调整发酵体系pH为5.2，校正溶氧DO达到100%后开始进行发酵:
首先加入甘油溶液进行增菌发酵，待甘油耗尽，菌液0D600达到90.0左右，再采用甲醇溶液分三阶段进行蛋白诱导发酵，发酵过程中温度持续维持在29°C，DO维持在20%以上(由于诱导前转速为600rpm，诱导后转速与溶氧下限20%自动串级，协同维持罐体内溶氧保持在20%以上)，甲醇诱导120h后，整个发酵过程结束。
[0007]当加入甘油溶液进行增菌发酵时，甘油溶液的加入流速为1.67 ml/min。
[0008]采用甲醇溶液进行蛋白诱导发酵时，甲醇溶液分三个阶段缓慢加入:第一阶段甲醇的补加流速为0.2ml/min，补加4h，停加甲醇2h ;第二阶段甲醇的补加流速为0.4ml/min，补加6h ;第三阶段甲醇的补加流速为1.5ml/min，补加108h ;总诱导发酵时长为120h。
[0009]所述甘油和甲醇溶液中，每升均含有12ml的PTM1 (微量元素盐溶液)。
[0010]本发明所述的重组毕赤酵母菌株为中华红林蚁Acetylcholinesterase重组毕赤酵母X33/pPICZ a A-Acetylcholinesterase菌株，其构建方法为:将pMD_19T/Acetylcholinesterase和表达载体pPICZ α Α进行酶切、连接，获得表达载体pPICZ a A-Acetylcholinesterase，将其转化大肠杆菌DH5 α，挑单克隆，鉴定出阳性质粒，转化酵母Χ33，筛选出多拷贝重组菌株X33/pPICZ a A-Acetylchol inesterase，经鉴定后保存备用。
[0011]本发明的优点在于发酵工艺简单，操作方便，蛋白可溶性表达且表达量高，酶活性高，但蛋白表达成本却较低。本发明首次在酵母表达系统内对乙酰胆碱酯酶进行了大规模的发酵罐表达，为AChE的大规模生产和最终应用奠定了基础。
【附图说明】
[0012]图1是本发明发酵过程中测得不同培养阶段的菌体湿重(mg/mL)。
[0013]图2是本发明与现有技术发酵培养工艺下的菌体湿重(mg/mL)。
[0014]图3是本发明中华红林蚁AChE的重组毕赤酵母X33高密度发酵上清液的SDS-PAGE电泳图谱。
[0015]图4是本发明中测得的不同培养阶段发酵上清中的AChE活性(U/mL)。
【具体实施方式】
[0016]下面通过具体实例对本发明发酵工艺做更加详细的说明。
[0017]第一步，准备基因工程菌
菌株采用中华红林蚁Acetylcholinesterase 重组毕赤酵母X33/pPICZ a A-Acetylchol inesterase 菌株，其构建方法为:
将 pMD_19T/ Acetylcholinesterase 和表达载体 pPICZα A 分别用EcoR1、Notl进行双酶切，回收目的产物用T4 DNA ligase连接，获得表达载体pPICZ a A-Acetylcholinesterase，将其转化大肠杆菌DH5 α，挑单克隆，鉴定出阳性质粒。
[0018]将pPICZ a A-Acetylchol inesterase用SacI单酶切线性化后，与毕赤酵母X33感受态细胞混勾进行电转化，转化物均勾涂布到Zeocin (100 μ g/mL)抗性的YPD培养基平皿，置29 °C恒温培养2~4天，在此培养基平板上长出的菌落为His+转化子。挑取平板中长势较好的菌落进行诱导表达，从而筛选出多拷贝重组菌株X33/pPICZ a A-Acetylchol inesterase，经鉴定后保存备用。
[0019]第二步，种子液制备
取出第一步保存的重组酵母工程菌并活化，在Zeocin (100 μ g/mL)抗性的YPD固体培养基上划线，待长出菌落后，从该板上挑取一个单克隆重组菌于一级种子YPD液体培养基中培养24小时左右，至菌体浓度0D600达到5.0-6.0，得到一级种子培养液；然后，10%接种量接种至BMGY培养基(共600mL)中，培养20小时左右，至菌体浓度0D600达到40.0，即得到发酵种子液。
[0020]其中所用的YPD液体培养基:称取1%的酵母粉，2%的蛋白胨和2%的葡萄糖，加水至所需体积，混合均匀后115°C灭菌20 min。冷却后置4°C保存备用。
[0021 ] 所用的BMGY液体培养基:将含1%的酵母粉，2%的蛋白胨的适量水溶液灭菌，然后加入0.22 μ m滤膜过滤除菌的1.34%的ΥΝΒ，0.1Μ磷酸盐缓冲液(pH6.0),410 5%生物素和10%甘油，混合均匀后4°C保存备用。
[0022]第三步，接种 1)接种前准备
配制BSM培养基:称量26.7mL H3P04(85%)，0.93g CaS04，18.2g K2S04，14.9g MgS04.7H20，4.13g KOH，40.0g甘油，加水至1L混合均匀后，121° C高温灭菌后保存备用。
[0023]配置微量元素盐溶液PTM1:6.0g CuS04.5Η20，0.08g Nal, 3.0g MnS04.Η20，0.2gNaMo04.2H20, 0.02g H3B04，0.5g CoCl2，20.0g ZnCl2，65.0g FeS04.7H20, 0.2g 生物素，5.0mL硫酸，加水至1L，用0.22 μ m滤膜过滤除菌，室温保存。
[0024]将发酵罐进行组装并清洗干净，并用PH 4.0、pH 6.8标准液校正发酵罐的pH电极探头，蠕动栗流量校准。设置发酵罐参数:温度29° C、转速600rpm、pH5.2、溶氧20%、罐压0.06MPa。将已配制好的发酵罐培养基BSM (15L)培养基倒入发酵罐(20L)中，121。C高压灭菌30min。高压开始时校正溶解氧D0为0%，待温度降至29°C灭菌即将结束时，设置好搅拌，通气后，校正溶解氧D0为100%。
[0025]2)接种
灭菌结束待冷却到29° C后，在火焰圈的保护下打开接种口加入5mL的消泡剂和浓度为4.35mL/L的PTM1溶液65.25mL，并用28%的氨水调节发酵罐培养基pH至5.2。将发酵工作种子液以4%的接种