量在火焰圈的保护下接种于全自动控制发酵罐中(装液量为20L)，自动流加氨水或磷酸控制pH值为5.2，调节好发酵设备的转速、空气流量、罐压0.06MPa，校正溶氧D0达100% (注:D0为相对溶氧水平，即将刚接种时的饱和溶氧水平设定为100%，发酵过程显示的溶氧水平为相对于饱和溶氧的数值)。
[0026]第四步，补料生长(增菌发酵)
接菌21~24h左右，待发酵罐中的甘油耗尽后，D0值有上升趋势，此时0D600约为70.00，湿重约为120mg/mL。以1.67mL/min的流速加入补料(含1.2%PTM1的50%甘油水溶液)600mL，6h后停止补料，此时0D600约为100.00。再培养4~6h后溶解氧D0值大幅度上升，此时甘油处于耗尽状态，培养体系0D600值应为120.00左右，菌体湿重为242mg/mL，此时菌体量达到预定要求。
[0027]从图1可以看出，在该发酵过程中菌体经过较短的适应期后进入对数生长期，菌体在12~30h生长非常迅速，湿重从37mg/mL增长到242mg/mL，而在18h至24h期间湿重仅从118 mg/mL增长到147 mg/mL，这是由于此时发酵罐培养基内的甘油几乎被耗尽，待补加50%甘油后至30h，菌体湿重可达242 mg/mL，此时通过补加甘油，菌体量已经达到预定要求。
[0028]第五步，甲醇诱导表达乙酰胆碱酯酶重组蛋白阶段
停止补加甘油后，菌体维持饥饿状态2~4小时，待甘油彻底耗尽，菌体湿重达到预定值时，开始分三阶段补加含1.2% PTM1的甲醇溶液开始诱导重组AChE的表达:第一阶段甲醇的补加流速为0.2ml/min，D0值要维持在20%以上，补加4h，停加甲醇2h ;第二阶段的补料甲醇的补加流速为0.4ml/min，补加6h ;第三阶段的甲醇补料流加速度为1.5ml/min，补加108h,至此在诱导120h后整个发酵过程结束，发酵过程中的温度均为29°C，D0值要维持在20%以上。
[0029]从图2可以看出，与现有技术采用的发酵方法(诱导条件:pH5.0，首先以0.115ml/min的速度流加含PTM1 12ml/L甲醇溶液4小时，接着再以0.23ml/min的速度继续流加4小时，最后再以0.345 ml/min的速度流加，诱导表达72h后结束发酵)进行对比，本发明工艺比现有技术工艺诱导出的蛋白活性更高，产量更多。图2显示不同培养条件下菌体湿重随时间的变化图，系列一为本发明的发酵工艺，系列二为现有技术发酵工艺。从而表示在发酵工艺中，不同的pH值、培养及诱导条件可大幅提高Acetylcholinesterase重组蛋白在毕赤酵母中的表达量。
[0030]对本发明诱导出的Acetylcholinesterase重组蛋白的鉴定:
(1)灌制12%的分离胶和5%的浓缩胶，取20μ 1不同培养阶段的发酵上清液进行SDS-PAGE电泳，经染色和脱色后观察Acetylcholinesterase重组蛋白的表达情况，见图3，随着诱导时间的延长，Acetylcholinesterase重组蛋白(64KD)的表达量在逐渐升高。
[0031]图3中:M.蛋白分子量标准Marker(从上到下大小为:99、66、44、29、20和14 KD)；1，X33重组菌未诱导时的发酵上清；2，甲醇诱导12h的发酵上清；3，甲醇诱导24h的发酵上清；4，甲醇诱导48h的发酵上清；5，甲醇诱导72h的发酵上清；6，甲醇诱导96h的发酵上清;
(2)重组AChE的酶活性检测。
[0032]原理:E1 lman法是利用乙酰硫代胆碱在AChE作用下分解为硫代胆碱和乙酸盐，硫代胆碱和5，5—二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色化合物5-硫-2-硝基苯甲酸，在410~420nm处有最大吸收峰，在一定范围内其浓度与吸收值呈线性关系。对其进行比色定量，水解产生的硫代胆碱量反映胆碱酯酶的活性值。
[0033]步骤:
(1)ρΗ8.0缓冲溶液:分别取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾用1L蒸馏水溶解。
[0034](2)硫代乙酰碘代胆碱溶液(底物):称取硫代乙酰碘代胆碱25mg，溶解于3.0mL双蒸水中，摇匀后置冰箱4V保存。
[0035](3) DTNB溶液(显色剂):称取DTNB 160mg和碳酸氢钠15.6mg，用20mL缓冲液溶解，置冰箱4°C保存。
[0036](4)在试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入0.lmL酶液，0.lmL显色剂，摇匀后于37°C放置15min。加入0.lmL底物摇匀，立即放入比色皿中，记录反应3min的吸光度变化值
ΔΑ0 ο
[0037](5)酶活力单位的计算公式为:
式中:AΑ为反应前后吸光度的差值；
V为反应体系总体积，本体系为2.810 3 L ；
V为样品体积，本体系为0.1 X 10 3 L ; ε为黄色产物的摩尔吸光系数，为1.36x104L/ (mol.cm)； t为反应时间3min ；
106为摩尔转化为微摩尔的转化系数；
1为比色皿宽度(cm)。
[0038]由于酶活力的计算过程较复杂，有时候酶活力的大小，可简单用反应前后的吸光度之差(△ A)来表征酶活力的大小，△ A值越大，表示酶活力越大。
[0039]取不同培养阶段的发酵上清液，根据上述检测酶活力方法进行酶活性检测并根据上述公式计算出本发明中不同生长阶段的酶活力大小，以及最终得到了 7686.27U/mL的重组 Acetylcholinesterase，见图 4。
[0040]图4中显示出重组Acetylcholinesterase活性随着时间的延长逐渐升高，在84h之前增长缓慢，从84h到108h酶活性大幅增长，之后无增长趋势，至120h发酵结束，最终得到 7686.27U/mL。
[0041]Acetylcholinesterase重组蛋白的分离:诱导表达120小时后结束发酵，发酵液经4°C，5000r/min离心后得到发酵上清，超滤浓缩后经真空冷冻抽干保存于-20°C备用，根据需要可以采用不同的方法进行纯化。
【主权项】
1.一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺，其特征在于: 首先将活化保存的重组毕赤酵母菌株进行培养，制得发酵工作种子液，然后将该发酵工作种子液按一定的接种量转接到基础盐培养基中，调整发酵罐温度29°C，罐压0.06 MPa,转速600rpm，利用氨水或磷酸调整发酵体系pH为5.2，校正溶氧DO达到100%后开始进行发酵: 首先加入甘油溶液进行增菌发酵，待甘油耗尽，菌液0D600达到90.0左右，再用甲醇溶液进行蛋白诱导发酵，发酵过程中温度持续维持在29°C，DO维持在20%以上，甲醇诱导120h，整个发酵过程结束。2.根据权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺，其特征在于:加入甘油溶液进行增菌发酵时，甘油溶液的加入流速为1.67 ml/min。3.根据权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺，其特征在于:采用甲醇溶液进行蛋白诱导发酵时，甲醇溶液分三个阶段缓慢加入:第一阶段甲醇的补加流速为0.lml/min，补加10h，停加甲醇2h ;第二阶段甲醇的补加流速为0.2ml/min，补加22h，停加甲醇约2h ;第三阶段甲醇的补加流速为0.5ml/min，补加84h ;总诱导发酵时长为120h。4.根据权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺，其特征在于:所述甘油和甲醇溶液中，每升均含有12ml的微量元素盐溶液。5.根据权利要求1所述的重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺，其特征在于:所述重组毕赤酵母菌株为中华红林蚁Acetylcholinesterase重组毕赤酵母X33/pPICZ a A-Acetylcholinesterase菌株，其构建方法为:将pMD_19T/Acetylcholinesterase和表达载体pPICZ α Α进行酶切、连接，获得表达载体pPICZ a A-Acetylcholinesterase，将其转化大肠杆菌DH5 α，挑单克隆，鉴定出阳性质粒，转化酵母Χ33，筛选出多拷贝重组菌株X33/pPICZ a A-Acetylchol inesterase，经鉴定后保存备用。
【专利摘要】本发明公开了一种重组乙酰胆碱酯酶在甲醇毕赤酵母中表达的中试发酵工艺：首先将活化的重组毕赤酵母菌株进行培养，制得发酵工作种子液，然后将该其转接到基础盐培养基中，氨水或磷酸调整发酵体系pH后接种，并加入适量微量元素溶液，生长至一定阶段后，加入甘油与微量元素的混合溶液，最后流加含微量元素的甲醇溶液进行蛋白诱导发酵，发酵过程中温度持续维持在29℃，DO维持在20%以上，甲醇诱导120h，整个发酵过程结束。本发明的发酵工艺简单，操作方便，蛋白可溶性表达且表达量高，酶活性高，但蛋白表达成本却较低。本发明首次在酵母表达系统内对乙酰胆碱酯酶进行了大规模的发酵罐表达，为AChE的大规模生产和最终应用奠定了基础。
【IPC分类】C12R1/84, C12N9/18
【公开号】CN105296444
【申请号】CN201510878108
【发明人】翁海波, 李倩, 孙召伟, 田柳杨
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月4日