类；二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或氯仿等卤代烃类；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁 醇等醇类；N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、二甲亚砜、水以及它们的混合溶剂。作为碱，优选为 碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠等无机碱。作为钯催化剂，优选为四（三苯基膦）钯、二（三苯基 膦）二氯化钯、氯化钯-1，Γ-二（二苯膦基）二茂铁、二氯双[二叔丁基（4-二甲基氨基 苯基）膦]钯等。
[0243][文献]
[0244]A.d. Mei jere和F.Diederich编，"Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions"，第 1 版，VCH Publishers Inc.，1997 年
[0245]日本化学会编"实验化学讲座（第5版）" 13卷（2005年）（丸善）
[0246](第三工序）
[0247] 本工序是通过将化合物（8-a)供于脱Boc反应来得到化合物（Ι-a)的工序。 本反应例如可以利用前述的伍斯（P.G.M.Wuts)和格林（T.W.Greene)著的"Greene's ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(第 4 版，2006 年）"中记载的方法进行。
[0248](原料合成1-2)
[0249]
[0250] 本制法是制造在第1制法和第2制法的原料化合物（1)中X与构成Y的环的C原 子键合且X为CH的化合物α-b)的方法。
[0251] (第一工序）
[0252] 本工序是通过将化合物（8-a)供于加氢反应来得到化合物（8-b)的工序。
[0253] 在该反应中，在氢气气氛下在对反应为惰性的溶剂中在金属催化剂的存在下对化 合物（8-a)通常搅拌1小时~5天。该反应通常在冷却下~加热下、优选为室温~60°C下 进行。作为在此所用的溶剂的例子，没有特别限定，可以举出甲醇、乙醇、2-丙醇等醇类；乙 醚、四氢呋喃（THF)、二氧杂环己烷、二甲氧基乙烷等醚类；水、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰 胺（DMF)、二甲亚砜以及它们的混合物。作为金属催化剂，优选使用钯碳、钯黑、氢氧化钯等 钯催化剂；铂板、氧化铂等铂催化剂；还原镍、雷尼镍等镍催化剂；（三苯基膦）氯化铑等铑 催化剂；还原铁等铁催化剂等。也可以使用相对于化合物（8-a)为等量~过量的甲酸或甲 酸铵作为氢源来代替氢气。
[0254] [文献]
[0255] M.Hudlicky著，"ReductionsinOrganicChemistry,第二版（ACSMonograph: 188) "，ACS, 1996 年
[0256] 日本化学会编"实验化学讲座（第5版）" 19卷（2005年）（丸善）
[0257] (第二工序）
[0258] 本工序是通过将化合物（8-b)供于脱Boc反应来得到化合物（1-b)的工序。本反 应可以依照原料合成1-1的第三工序进行。
[0259] (原料合成1-3)
[0260]
[0261] 本制法是制造在第1制法和第2制法的原料化合物（1)中X与构成Y环的C原子 键合且X为N的化合物（1-C)的方法。
[0262](第一工序）
[0263] 本工序是基于化合物（6)的反应性的不同而与化合物（9)进行取代反应或偶联反 应来得到化合物（8-c)的工序。
[0264] 在Lv2与Y1中的-C=N-结构的C原子键合等化合物（6)的反应性较高的情况下， 可以通过与化合物（9)的取代反应而得到化合物（8-c)。本反应可以与第2制法同样地进 行。
[0265] 另外，在化合物（6)的反应性较低的情况下，可以通过与化合物（9)的偶联反应而 得到化合物（8-c)。本反应中，使用等量或一方过量的化合物（6)和化合物（9)，将它们的 混合物在对反应为惰性的溶剂中或无溶剂条件下在规定的催化剂的存在下在室温~加热 回流下通常搅拌0.1小时~5天。本反应优选在惰性气体气氛下进行。作为在此所用的溶 剂的例子，没有特别限定，可以举出苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃类；乙醚、四氢呋喃（THF)、 二氧杂环己烷、二甲氧基乙烷等醚类；二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿等卤代烃类；N-甲基 吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙腈、叔丁 醇以及它们的混合物。作为规定的催化剂，可以举出乙酸钯、三（二亚苄基丙酮）二钯、氯 化（2_二环己基勝基_2'，6'-二异丙氧基_1，1' -联苯）[2_ (2_氛基乙基）苯基]钮叔 丁基甲基醚加成物等。另外，使用钯催化剂的情况下，作为其配体，也可以使用三苯基膦、 1，1' _联蔡_2, 2' -二基双（二苯基勝）、2_(二环己基勝基）_2'，4'，6' -二异丙基_1，1' -联 苯、4, 5-双（二苯基膦基）-9, 9-二甲基氧杂蒽、二环己基（2'，6' -二异丙氧基联苯-2-基） 膦。另外，在三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或N-甲基吗啉等有机碱、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯 或氢氧化钾等无机碱、叔丁醇钠、或者六甲基二硅基氨基锂的存在下进行反应有时在使反 应顺利进行方面有利。通过微波照射加热反应混合物有时在使反应顺利进行方面有利。
[0266][文献]
[0267]S.R.Sandler和W.Karo著，"OrganicFunctionalGroupPreparations"，第 2 版，第 1 卷，AcademicPressInc.，1991 年
[0268] 日本化学会编"实验化学讲座（第5版）" 14卷（2005年）（丸善）
[0269](第二工序）
[0270] 本工序是将化合物（8-c)供于脱Boc反应来得到化合物（1-c)的工序。本反应可 以依据原料合成1-1的第三工序进行。
[0271](原料合成2)
[0273](式中，YB是指式（I)的化合物中的Y中由构成环的N原子与X键合的基团，R是 指低级烷基。需要说明的是，化合物（10)中的Η健合于构成YB的环且与化合物（Ι-d)中 的哌啶环4位的C原子键合的N原子。）
[0274] 本制法是制造在第1制法和第2制法的原料化合物（1)中X与构成Y环的N原子 键合且X为CH的化合物（Ι-d)的方法。
[0275] (第一工序）
[0276] 本工序是通过化合物（10)与化合物（ΙΙ-a)的烷基化反应、或者化合物（10)与化 合物（ΙΙ-b)的光延反应来得到化合物（12)的工序。
[0277] 本工序的烷基化反应可以依据第2制法进行。
[0278] 另外，本工序的光延反应按如下方式进行：使用等量或者一方过量的化合物（10) 和（11-b)，将它们的混合物在甲苯等对反应为惰性的溶剂中在氰基亚甲基三丁基膦的存在 下在室温~加热回流下通常搅拌〇. 1小时~5天，由此进行反应。
[0279] (第二工序）
[0280] 本工序是将化合物（12)供于水解反应来得到化合物（13)的工序。本反应例如 可以利用前述的伍斯（P.G.M.Wuts)和格林（T.W.Greene)著的"Greene'sProtective GroupsinOrganicSynthesis(第 4 版，2006 年）"中记载的方法进行。
[0281] (第三工序）
[0282] 本工序是通过将化合物（13)与化合物（5)供于酰胺化反应来得到化合物（8-d) 的工序。本反应可以依据原料合成1-1的第一工序来进行。
[0283] (第四工序）
[0284] 本工序是通过将化合物（8-d)供于脱Boc反应来得到化合物（Ι-d)的工序。本反 应可以依据原料合成1-1的第三工序进行。
[0285] 式（I)的化合物以游离化合物、其盐、水合物、溶剂合物、或者多晶型物质的形式 被分离、纯化。式（I)的化合物的盐也可以通过供于常规方法的成盐反应来制造。
[0286] 对于分离、纯化而言，应用萃取、分级结晶、各种分级层析等通常的化学操作来进 行。
[0287] 各种异构体可以通过选择适当的原料化合物来制造，或可以利用异构体间的物理 化学性质的差异进行分离。例如，旋光异构体可以通过外消旋体的常规光学拆分法（例如 产生与光学活性的碱或酸的非对映异构体盐的分级结晶、使用手性柱等的色谱等）而得 至IJ，另外，也可以由适当的光学活性的原料化合物制造。
[0288] 式（I)的化合物的药理活性通过以下的试验进行确认。
[0289] 试验例1人线粒体复合物I抑制作用的评价
[0290]从MDA-MB-453肿瘤提取线粒体，并评价受试化合物的复合物I抑制活性。
[0291 ] 在裸鼠皮下荷癌人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-453细胞，取出MDA-MB-453肿瘤，加入肿瘤重量的9倍量的线粒体提取溶液（0. 25M蔗糖，2mMEDTA，10mM Tris/HClpH7. 5)，进行破碎。在600Xg、4°C的条件下离心10分钟，得到上清液后，在 14000Xg、4°C的条件离心10分钟，从而得到沉淀。将沉淀悬浮在所取出的肿瘤重量的5倍 量的10mMTris/HClpH7. 5中，从而得到人线粒体悬浊液。
[0292]接下来，每1ml复合物I活性测定用液（200mM磷酸钾pH7.6,0. 35%牛血清白蛋 白（BSA)，60μΜ2, 6-二氯靛酸，70μΜ癸基泛醌，1μΜ抗霉素）加入25μ1的人线粒体混 悬液。分配至96或者384孔板中后，添加受试化合物（从10000ηΜ到0. 3ηΜ)和作为阴性 对照的受试化合物的溶剂即DMSO以使作为阳性对照的复合物I抑制剂即鱼藤酮的终浓度 为1μM。此外，加入NADH以使其终浓度为0. 2mM，利用预先设定为37°C的SpectraMax(分 子仪器公司）测定在波长600nm处的吸光度的变化。将用DMS0处理的信号值设为top值， 将用鱼藤酮1μΜ处理的信号值设为bottom值，在反应为线性的范围内计算信号的变动，利 用逻辑回归法计算50%抑制值（IC5。)。将几个式（I)的化合物的结果示于表1中。需要说 明的是，在表中，Ex表不下文中的实施例编号（以下相同）。
[0293][表1]
[0294]
[0295] 试验例2 AMPK活化作用的评价
[0296] 利用Cell酶联免疫吸附（ELISA)测定AMPK的底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC)的第 79位的丝氨酸（Ser79)的磷酸化，由此评价由受试化合物产生的AMPK活化作用。
[0297] 将MDA-MB-453细胞以每孔为15000个细胞的方式用每孔36μ1的含有10%胎牛 血清的Leibovitz'sL-15培养基（Lifetechnologies公司）接种于384孔板中，在不存 在C02的条件下在37°C培养一夜。次日，用新鲜培养基将受试化合物、和作为阴性对照的 受试化合物的溶剂即DMS0稀释成终浓度的10倍浓度，在各孔中每孔添加4μ1 (受试化合 物终浓度为从ΙΟΟΟΟηΜ到0. 3ηΜ的10个梯度、DMS0终浓度为0. 1 % )。之后，在不存在C02 的条件下在37°C培养2小时。培养后，在各孔中添加20μ1的40%乙二醛溶液（Nacalai Tesque公司），在室温下静置30分钟，由此将细胞固定。之后，对板进行离心由此除去上清 液，在各孔中每孔添加20μ1的含有0. 1 %TritonX-100的磷酸盐缓冲液（PBS)，在室温下 静置10分钟。以SOOrpm离心8秒钟（以下的利用离心的溶液除去操作均为相同条件），除 去含有0. 1 %TritonX-100的PBS，在各孔中每孔添加20μ1的封闭液（ODYSSEYBlocking Buffer;Li_C0RBiosciences公司），在室温下静置1小时。通过离心除去封闭液，向各孔中 各添加将作为第一抗体的ACCSer79的磷酸化抗体（CellSignaling公司）稀释为1/500 量而得到的封闭液10μ1，并在4°C静置一夜。次日，对板进行离心以除去反应液，在各孔 中每孔添加25μ1的含有0. 05%Tween-20的三乙醇胺缓冲盐水溶液（赛默飞世尔科技公 司；将20XTBSTween-20用离子交换水稀释，以IX使用），然后进行离心除去，由此清洗 各孔。各孔的清洗重复进行共计3次。清洗后，向各孔中各添加将作为第二抗体的IRDye 800CW山羊抗兔IgG(Li-CoRBiosciences公司）稀释为1/1000量而得到的封闭液10μ1， 并在室温下静置1小时。第二抗体反应后，对板进行离心以除去反应液，利用含有0. 05% Tween-20的TBS与第一抗体反应后同样地将各孔清洗3次。除去清洗液后，直接将板在室 温风干3小时以上，利用Aerius(Li_CoRBiosciences公司）测定信号。将用DMSO处理的 信号值设为bottom值、达到平台时的信号值设为top值，利用逻辑回归法计算50%活化值 (EC5。）。将几个式⑴的化合物的结果示于表2中。
[0298][表 2]
[0299]
[0300] 试验例3对于人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-453细胞的非锚定依赖性 生长的增殖抑制作用的评价
[0301] 评价了受试化合物对癌细胞增殖的作用。
[0302] 非锚定依赖性生长的细胞增殖的测定（集落法）作为研究受试化合物的抗癌作用 的体系而为人所知。作为代替集落法的测定细胞非粘附性的增殖的方法，有以下的使用非 粘附板的方法。
[0303] 在384孔非粘附板（Lipidure-CoatplateAT-384 ;日油株式会社）中，用36μ1/ 孔的含有10%胎牛血清的Leibovitz'sL-15培养基（Lifetechnologies公司）接种人 PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-453细胞以使得每孔有500个细胞，在0)2存在下在 37°C培养一夜。次日，用培养基稀释受试化合物（终浓度从10000nM至0.InM的11个梯 度）、和作为阴性对照的受试化合物的溶剂即DMS0,并向细胞中添加4μ1。之后，在不存在 C02的条件下在37°C培养4天，添加细胞数测定试剂（CellTiter-Glo发光法细胞活力检测 试剂盒；普洛麦格公司），搅拌30分钟后，使用发光测定装置（ARV0 ;珀金埃尔默公司）进行 测定。将仅利用培养基时的测定值设为100%抑制、将阴性对照的测定值设为〇%抑制，计 算出受试化合物的抑制率（％)，通过逻辑回归法求出50%抑制浓度（IC50值）。将几个式 (I)的化合物的结果示于表3中。
[0304][表 3]
[0305]
[0306] 试验例4人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-453细胞荷癌小鼠中的抗肿瘤 作用的评价
[0307] 将悬浮于PBS中的MDA-MB-453细胞3X106个注射种植于5-6周龄的雄性Balb/ c裸鼠（日本CharlesRiver司）的背部皮下。种植10日后，开始给用受试化合物。试验 以溶剂组和受试化合物给药组各5只来进行，对溶剂组口服给用6%环糊精水溶液；对于受 试化合物给药组，在6%环糊精水溶液中混合受试化合物（1或者3mg/kg)后口服给用。给 药1天1次，进行15天，大致每隔一天测定体重和肿瘤直径。肿瘤体积的计算使用以下的 公式。
[0308] [肿瘤体积（mm3)]=[肿瘤的长径（mm) ]X[肿瘤的短径（mm) ]2Χ0· 5
[0309] 将受试化合物给药起始日的受试化合物给药组的肿瘤体积和给药结束日的溶剂 组的肿瘤体积分别设为100%抑制、0%抑制，计算出受试化合物的抑制率（％)。另外，受试 化合物给药组的肿瘤体积小于给药起始日的肿瘤体积的情况下，将受试化合物给药起始曰 的肿瘤体积设为0%退化（即100%抑制）、将肿瘤体积为0设为100%退化，计算出受试化 合物的退化率（％ )。将几个式（I)的化合物的结果示于表4中。
[0310] [表 4]
[0311]
[0312] 需要说明的是，如下述试验例所示的那样，在试验例4中确认到抗肿瘤作用的人 PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-453细胞是MCT4未表达的人PIK3CA突变阳性乳腺 癌细胞株。
[0313] 试验例5几种人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株荷癌小鼠中的抗肿瘤作用的评价
[0314] 与试验例4的方法相同，评价受试化合物对于均为人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞 株的BT-474细胞、HCC1954细胞、MDA-MB-361细胞、CAL-51细胞和0CUB-M细胞在荷癌小鼠 中的抗肿瘤作用。
[0315] 其结果是，受试化合物对于BT-474细胞和0CUB-M细胞以8mg/kg的给药量表现出 肿瘤的退化作用，对于此外的HCC1954细胞、MDA-MB-361细胞和CAL-51细胞未表现出50 % 抑制以上的抗肿瘤作用。
[0316] 试验例6几种人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株中的MCT4表达量的测定
[0317] 使用以下的方法，对MDA-MB-453细胞（试验例4)、以及BT-474细胞、HCC1954细 胞、MDA-MB-361细胞、CAL-51细胞和0CUB-M细胞（以上试验例5)的肿瘤中的MCT4的表达 量进行了测定。
[0318] 从在试验例4或试验例5中结束给用受试化合物后的荷癌小鼠提取溶剂给药 组的肿瘤，立即用液氮冷冻。向提取的肿瘤的一部分添加CelLyticMT(SIGMA公司）、 蛋白酶抑制剂混合物（罗氏公司）和磷酸酶抑制剂混合物（SIGMA公司）的混合液，利 用TissueLyserII(QIAGEN公司）使肿瘤均质化。利用NuPAGE4-12%Bis_Tris凝胶 (Lifetechnologies公司）将等量的肿瘤蛋白溶解液进行电泳，转移至PVDF膜。利用PVDF BlockingReagentforCanGetSignal液（东洋纺公司）进行封闭后，利用MCT4抗体 (H90 ;圣克鲁斯公司）使PVDF膜在4°C反应一夜。PVDF膜在清洗后，用辣根过氧化物酶标 记兔IgG抗体（通用电气医疗公司）在室温下使之反应1小时。对PVDF膜进行清洗后，使 用ECL检测试剂盒（通用电气医疗公司）测定了MCT4表达量。
[0319] 其结果是，上述实验条件中，在MDA-MB-453细胞、BT-474细胞和0CUB-M细胞的肿 瘤中确认MCT4未充分表达。另一方面，在此外的HCC1954细胞、MDA-MB-361细胞和CAL-51 细胞的肿瘤中确认MCT4充分表达。
[0320] 该MCT4的表达与在试验例4和试验例5中所示的受试化合物的抗肿瘤作用密切 相关。即，受试化合物对于MCT4未表达的人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株的肿瘤表现出 肿瘤退化作用，另一方面，对MCT4已表达的人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株的肿瘤未表现 出50%抑制以上的抗肿瘤作用。
[0321] 试验例7对于几种不具有PIK3CA的突变的人乳腺癌细胞株的非锚定依赖性生长 的细胞增殖的抑制作用的评价和MCT4表达量的测定
[0322] 为了确认式（I)的化合物的细胞增殖抑制作用与该细胞中的MCT4的表达之间相 关，对于不具有PIK3CA的突变的人乳腺癌细胞株也研究了受试化合物的细胞增殖抑制作 用与MCT4的表达之间的关系。
[0323] 受试化合物的细胞增殖抑制作用如下所述进行评价。在96孔非粘附板 (MS-0096S;Sumiron公司）中，用90μ1/孔的含有10%胎牛血清的RPMI培养基（SIGMA 公司）接种作为不具有PIK3CA的突变的人乳腺癌细胞株的HCC1500细胞、ZR-75-30细胞、 HCC2218细胞、SK-BR-3细胞、AU565细胞、HCC1569细胞、HCC1806细胞和CAL-120细胞以使 得每孔为1000个细胞，在〇)2存在下在37°C培养一夜。次日，将受试化合物（终浓度为从 3000nM到0. 3nM的9个梯度）、和作为阴性对照的受试化合物的溶剂即DMSO用培养基稀释， 并向细胞中添加10μ1。之后，在不存在C02的条件下在37°C培养4天，添加细胞数测定试 剂（CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒；普洛麦格公司），搅拌30分钟后，使用发 光测定装置（ARVO;珀金埃尔默公司）进行测定。将测定值0设为100%抑制、将阴性对照 的测定值设为〇%抑制，计算出受试化合物的抑制率（％)。
[0324] 各细胞株的MCT4表达量如下所述进行测定。在6孔粘附板（IWAKI公司）中，用 2ml/孔的含有10 %胎牛血清的RPMI培养基，接种上述细胞株以使得每孔为500000个细 胞，在0)2存在下在37°C培养一夜。次日，在各孔中每孔添加2μ1的受试化合物（终浓度 ΙΟΟηΜ)和作为阴性对照的DMS0。将受试化合物和DMS0添加至培养基后，在37°C培养2小 时后除去培养基，用冰冷PBS500μ1对各孔进行一次清洗，然后再次添加500μ1的冰冷 PBS，在冰上用细胞刮棒回收细胞。用冰冷PBS500μ1对各孔进行一次清洗，并与之前回收 的细胞混悬液合并。将回收的细胞悬浊液在3000rpm、4°C的条件下离心5分钟，然后除去上 清得到颗粒，向颗粒中添加CelLyticM(SIGMA公司）、蛋白酶抑制剂混合物（SIGMA公司） 和磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞世尔科技公司）的混合液。移液后在冰上静置30分钟，然 后在12000rpm、4°C的条件下离心5分钟，将上清置于其它管中，作为SDS-PAGE用的蛋白质 溶解液。使用5% -20%SDS聚丙烯酰胺凝胶（和光公司）对等量的蛋白质进行电泳，以与 试验例6同样的方法测定了MCT4的表达量。
[0325] 其结果是，在上述实验条件中，在作为MCT4的表达不充分且不具有PIK3CA的突 变的人乳腺癌细胞株的HCC1500细胞、ZR-75-30细胞和HCC2218细胞中，受试化合物添加 ΙΟΟηΜ时表现出80%抑制以上的细胞增殖抑制作用，另一方面，在作为MCT4充分表达的不 具有PIK3CA的突变的人乳腺癌细胞株的SK-BR-3细胞、AU565细胞、HCC1569细胞、HCC1806 细胞和CAL-120细胞中，受试化合物添加ΙΟΟηΜ时未表现出50%抑制以上的细胞增殖抑制 作用。
[0326] 上述试验的结果确认到，式（I)的化合物具有复合物I抑制作用和ΑΜΡΚ活化作 用。另外确认到，式（I)的化合物对于MCT4未表达的人PIK3CA突变阳性乳腺癌细胞株 MDA-MB-453细胞具有细胞增殖抑制作用，以及在MDA-MB-453细胞荷癌小鼠中表现出抗肿 瘤作用。此外确认到，式（I)的化合物不仅对于MCT4未表达的人PIK3CA突变阳性乳腺癌 细胞株具有细胞增殖抑制作用，而且对MCT4未表达且不具有PIK3CA的突变的人乳腺癌细 胞株也具有细胞增殖抑制作用。因此，式（I)的化合物可以用于乳腺癌、尤其是MCT4未表 达的乳腺癌、特别是MCT4未表达的PIK3CA突变阳性乳腺癌的治疗。
[0327] 含有式（I)的化合物或其盐的1种或2种以上作为有效成分的药物组