利用转基因微藻生产虾青素的方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及微藻表达载体，以及使用β -胡萝卜素酮化酶（BKT)和β -胡萝卜素 羟化酶（CHYB)在转基因微藻中生产虾青素的方法。具体而言，本申请涉及构建微藻表达载 体，包含β-胡萝卜素酮化酶基因（ΒΚΤ)和β-胡萝卜素羟化酶基因（CHYB)的微藻表达载 体，包含所述微藻表达载体的微藻，使用ΒΚΤ和CHYB在微藻中生产虾青素的方法，使用所述 微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻 中的应用，以及所述微藻表达载体在生产虾青素中的应用。
【背景技术】
[0002] 虾青素化学名称是3,3< -二羟基_4,4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素[1]，分子 量式C4(]H5204。是一种非维生素 Α原的类胡萝卜素，也是类胡萝素合成的最高级别产物[1]， 是迄今为止自然界中发现的最强的抗氧化剂，具有强大的抗氧化活性[2]，其抗氧化性是类 胡萝卜素的10倍、维生素 E的550倍[3]，被誉为"超级抗氧化剂"。
[0003] 虾青素具有重要的生理生化功能。它能向自由基提供电子而生成相应的阳离子基 团或吸引自由基的未配对电子形成加合物，从而清除自由基，起到抗氧化作用[4]。过量的羟 自由基会导致机体衰老，清除羟自由基可以调节DNA和重要生命物质的修复过程[5]，因此 虾青素具有增强免疫力、抵抗癌症的作用a6]。虾青素对转谷胺酰胺酶具有特殊作用，能够 在皮肤受光时消耗腐胺[7]，因此其可以防止皮肤衰老。又由于酯化的虾青素可以穿过血脑 屏障，因此其对中枢神经系统健康具有重要的生理功能M。酯化态的虾青素易与蛋白质形 成复合物，会产生不同的颜色[2]，因此被广泛的应用于饲料、食品添加剂中。绝大多数海产 甲壳类动物和鱼类都含有虾青素，但都是通过食物链从海洋微藻、浮游植物和浮游动物中 获得的[9]。这些海产动物通常都是人类的日常膳食，对人体安全[2]。因此虾青素在保健品、 功能食品、医药、化妆品、饲料添加剂及食品添加剂等方面都有广阔的应用前景[1°]。
[0004] 但是，虾青素的来源有限，产量远远供不应求。虾青素主要分为人工合成和生物合 成，生物合成又分为天然生物合成和转基因生物合成。虾青素最初是从河螯虾外壳、牡蛎和 鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，但是河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中的虾青素含量低、提取 工艺复杂，此外河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼的来源受到季节的限制。人工合成的虾青素，由于 合成工艺复杂，仅有25%为左旋结构，且都是游离形式的奸青素，目前人工合成的奸青素只 能用于饲料添加剂，限制了人工合成虾青素的发展。
[0005] 目前天然奸青素主要来源于雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)，而雨生红 球藻具有生长周期长、易污染、细胞密度低等缺点导致虾青素的产率较低[11]，造成天然虾 青素价格昂贵、供不应求。通过优化雨生红球藻的培养工艺或通过筛选突变体来解决虾青 素产量低的问题至今尚未取得突破性进展。
[0006] 小球藻含有丰富的营养价值，具有生长周期短、细胞密度高、可以进行异养、混养 和光自养等营养方式进行快速生长等特点，因而在食品、医药、饲料以及能源等领域具有广 泛的应用价值。申请人所在团队前期在国内外首次揭示了一株工业用蛋白核小球藻的全 基因图谱，并已建立了蛋白核小球藻的电击转化方法，实现了其基因工程改造（参见闰从 林《蛋白核小球藻外源基因表达系统的初步建立及其优化》，华东理工大学硕士毕业论文， 2014)〇
[0007] 研究表明，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)合成4下青素的过程中， β -胡萝卜素酮化酶（β-carotene ketolase，BKT)是限速酶[12]，能够以β -胡萝卜素 (β-carotene)和玉米黄素（Zeaxanthin)为底物，形成角黄素（Canthanxanthin)和4下青 素 。β -胡萝卜素轻化酶（β-carotene hydroxylase，CHYB)是一种非血红素双铁单加氧 酶，催化β -胡萝卜素形成玉米黄素。因此，β -胡萝卜素酮化酶和β -胡萝卜素羟化酶在 生成虾青素的过程中起重要的作用。
[0008] 有文献报道通过基因工程改造，可以将雨生红球藻（Haematococcus pluvialis) 的β-胡萝卜素酮化酶（HpBKT)和β-胡萝卜素羟化酶（HpCHYB)引入高等植物（例如烟 草[1315]、番茄[16]、拟南芥[12])中来生成虾青素。但是转基因植物种植周期长、含量低、提取 工艺复杂、成本高等缺点都限制了其发展。
[0009] 也有文献报道通过基因工程改造将雨生红球藻的β -胡萝卜素酮化酶（HpBKT)和 胡萝卜素羟化酶（HpCHYB)引入微生物（例如油脂酵母、大肠杆菌[17])中来生成虾青素。 但是转基因微生物不能生成酯化形式的虾青素。
[0010] 但是现在还没有任何文献报道在微藻中，表达β-胡萝卜素酮化酶（HpBKT)和 β-胡萝卜素羟化酶（HpCHYB)来生产虾青素的方法。
【发明内容】
[0011] 针对现有技术存在的技术问题，本申请利用基因工程技术构建微藻表达载体，并 且使用内源性启动子表达β-胡萝卜素酮化酶（BKT)和β-胡萝卜素羟化酶（CHYB)在转 基因微藻中生产虾青素。具体而言，本申请涉及构建微藻表达载体，包含胡萝卜素酮化 酶基因（ΒΚΤ)和β-胡萝卜素羟化酶基因（CHYB)的微藻表达载体，包含所述微藻表达载体 的微藻，使用ΒΚΤ和CHYB在微藻中生产虾青素的方法，使用所述微藻表达载体制备生产虾 青素的转基因微藻的方法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，以及所述微藻 表达载体在生产虾青素中的应用。
[0012] 本申请的技术方案使用蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子表达β-胡萝卜素 酮化酶（ΒΚΤ)和β-胡萝卜素羟化酶（CHYB)在蛋白核小球藻等藻株中生产虾青素。与 现有技术中的虾青素生产方法相比，本申请的技术方案有如下优势：（1)与雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis)和小球藻（Chlorella zofingiensis)相比，蛋白核小球藻已 被联合国粮农组织（FA0)列为21世纪人类的绿色营养源健康食品；（2)与雨生红球藻相 比，蛋白核小球藻生长周期短、细胞密度高、并且既可以进行自养又可以进行兼养和异养等 多种培养方式；（3)与小球藻（Chlorella zofingiensis)相比，针对于蛋白核小球藻，本实 验室创立了一项微藻培养领域崭新的平台技术一一"异养一稀释一光诱导"技术（参见中国 专利申请号200610025618. 9,《高密度高品质培养小球藻的方法》，该专利通过引用全文并 入本申请），按照目前的培养工艺，蛋白核小球藻的平均生长速率不低于3g/L/h，即蛋白核 小球藻的培养工艺更加成熟；(4)与红发夫酵母和海洋细菌Agrobacterium aurantiacum 相比，蛋白核小球藻理论上可以生产所需要的反式结构酯化形式的虾青素；（5)与转基因 番茄、烟草、拟南芥相比，蛋白核小球藻具有光合效率高、生长速度快、生长周期短、对不同 的生态系统适应能力强、"不与人争粮，不与粮争地"等优势[18]，并且蛋白核小球藻富含蛋 白、小球藻生长因子等其他高附加值产物可以用于水产养殖，从而避免了转基因食物的恐 慌；（6)本申请使用蛋白核小球藻的内源性热激蛋白（HSP)70启动子，相对于外源性启动子 (例如CaMV 35S启动子、SV40启动子或pCMV启动子），内源性启动子的优点是不利于导致 基因沉默，更加有利于外源基因的表达。
[0013] 根据本申请的一个方面，本申请提供了微藻表达载体，所述微藻表达载体包含微 藻的内源性启动子，所述内源性启动子可以用于在微藻中控制表达蛋白。
[0014] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体选自pGreen、pGreenOOOO、 pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambial300、或 pBlueScript SK/KS 系列载体。
[0015] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体为pGreen0029-HSP载体。
[0016] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是内源性热激蛋白（HSP) 启动子、泛素启动子、或N0S启动子。
[0017] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是内源性热激蛋白70启 动子。
[0018] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是蛋白核小球藻的内源性 启动子。
[0019] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是蛋白核小球藻的内源性 热激蛋白70启动子。
[0020] 根据本申请的一个方面，本申请提供了微藻表达载体，所述微藻表达载体包含 胡萝卜素酮化酶基因（BKT)和β-胡萝卜素羟化酶基因（CHYB)，并且所述微藻表达载 体包含启动子、终止序列和抗生素抗性基因。
[0021] 根据本申请的某些实施方式，所述ΒΚΤ基因是克隆自雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)的 HpBKT 基因。
[0022] 根据本申请的某些实施方式，所述CHYB基因是克隆自雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis)的 HpCHYB 基因。
[0023] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体选自pGreen、pGreenOOOO、 pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambial300、或 pBlueScript SK/KS 系列载体。
[0024] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体为pGreen0029-HSP载体。
[0025] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子选自热激蛋白（HSP)启动子、泛素启动 子、或N0S启动子。
[0026] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。
[0027] 根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。
[0028] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。
[0029] 根据本申请的某些实施方式，所述BKT基因和所述CHYB基因分别连接各自的启动 子。
[0030] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体通过如下方法构建而得：将BKT 基因插入到所述微藻表达载体中，得到包含BKT基因的微藻表达载体（pBKT);用CHYB基因 代替所述包含BKT基因的微藻表达载体（pBKT)中的BKT基因片段，从而得到包含CHYB基 因的微藻表达载体（pCHYB)，再将所述载体上的启动子：：CHYB::终止序列通过PCR扩增和 酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表达载体（pBKT)中，从而得到包含BKT基因和CHYB基 因的微藻表达载体。
[0031] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了包含如申请所述的微藻表达载体的微 藻。
[0032] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp·)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0033] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了使用胡萝卜素酮化酶（BKT)和 胡萝卜素羟化酶（CHYB)在微藻中生产虾青素的方法。
[0034] 根据本申请的某些实施方式，所述方法包括构建包含ΒΚΤ和CHYB的微藻表达载 体，将所述微藻表达载体转化到微藻中表达，其中所述微藻表达载体包含启动子、终止序列 和抗生素抗性基因。
[0035] 根据本申请的某些实施方式，所述ΒΚΤ包含经修饰的ΒΚΤ，或者ΒΚΤ的嵌合蛋白、截 短蛋白或蛋白结构域，或者所述CHYB包含经修饰的CHYB，或者CHYB的嵌合蛋白、截短蛋白 或蛋白结构域。
[0036] 根据本申请的某些实施方式，所述BKT包含与BKT的相同性为至少约70 %的序列， 或者所述CHYB包含与CHYB的相同性为至少约70 %的序列