。
[0037] 根据本申请的某些实施方式，所述BKT是来自雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)的 HpBKT。
[0038] 根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是来自雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)的 HpCHYB。
[0039] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体选自pGreen、pGreenOOOO、 pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambial300、或 pBlueScript SK/KS 系列载体。
[0040] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体为pGreen0029-HSP载体。
[0041] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子选自热激蛋白（HSP)启动子、泛素启动 子、或N0S启动子。
[0042] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。
[0043] 根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。
[0044] 根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。
[0045] 根据本申请的某些实施方式，所述BKT基因和所述CHYB基因分别连接各自的启动 子。
[0046] 根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导 法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
[0047] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0048] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体通过如下方法构建而得：将BKT 基因插入到所述微藻表达载体中，得到包含BKT基因的微藻表达载体（pBKT);用CHYB基因 代替所述包含BKT基因的微藻表达载体（pBKT)中的BKT基因片段，从而得到包含CHYB基 因的微藻表达载体（pCHYB)，再将所述载体上的启动子：：CHYB::终止序列通过PCR扩增和 酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表达载体（pBKT)中，从而得到包含BKT基因和CHYB基 因的微藻表达载体。
[0049] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了使用本申请所述的微藻表达载体制备生 产虾青素的转基因微藻的方法，所述方法包括构建如本申请所述的微藻表达载体，将所述 微藻表达载体转化到微藻中，使得BKT和CHYB基因在转基因微藻中表达，并且催化所述微 藻本身的类胡萝卜素生成虾青素。
[0050] 根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导 法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
[0051] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp·)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0052] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了本申请所述的微藻表达载体在制备转基 因微藻中的应用，所述应用包括构建如本申请所述的微藻表达载体，将所述微藻表达载体 转化到微藻中，使用抗生素选择性压力下获得生产虾青素的转基因藻株。
[0053] 根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导 法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
[0054] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp·)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0055] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了本申请所述的微藻表达载体在生产虾青 素中的应用，所述应用包括构建如本申请所述的微藻表达载体，将所述微藻表达载体转化 到微藻中，使得BKT和CHYB基因在转基因微藻中表达，并且催化所述微藻本身的类胡萝卜 素生成虾青素。
[0056] 根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导 法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
[0057] 根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圆小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原壳小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp·)、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0058] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了根据本申请所述的微藻表达载体制备转 基因微藻的方法所制备获得的产虾青素的转基因微藻。
[0059] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了根据本申请所述方法获取的转基因微藻 作为提取虾青素的原材料的应用。
[0060] 根据本申请的另一个方面，本申请提供了根据本申请所述方法获取的转基因微藻 在制备动物养殖品、保健食品或化妆品中的应用。
【附图说明】
[0061] 图1显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP的构建；
[0062] 图2显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP-HpBKT的构建；
[0063] 图3显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP-HpCHYB的构建；
[0064] 图4显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB的构建；
[0065] 图5显示了转基因小球藻异养生长曲线，WT表示野生型对照；
[0066] 图6显示了转基因微藻虾青素 HPLC图谱，其中箭头标出角黄素标品、虾青素标品、 野生型藻株、以及BKT转基因的微藻株B7-7和BKT-CHYB转基因的微藻株BC9-1 ;和
[0067] 图7显示了换算虾青素浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0068] 除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通 技术人员通常所理解的含义。
[0069] 本申请涉及构建微藻表达载体，包含β -胡萝卜素酮化酶基因（BKT)和β -胡萝 卜素羟化酶基因（CHYB)的微藻表达载体，包含所述微藻表达载体的微藻，使用ΒΚΤ和CHYB 在微藻中生产虾青素的方法，使用所述微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方 法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，以及所述微藻表达载体在生产虾青素 中的应用。
[0070] "修饰"是指对天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列进行一种或多种改变。所 述修饰包括在蛋白的Ν末端或C末端加入多肽序列，在蛋白的Ν末端或C末端删除一段氨 基酸序列，或者在不改变蛋白功能的情况下蛋白序列中的一种或多种氨基酸取代、插入、重 复或缺失等，例如将甘氨酸取代为丙氨酸。
[0071] "突变"是指天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列发生改变，包括但不限于单 个碱基改变所引起的点突变，或者多个碱基的缺失、重复和插入。"突变蛋白"又称为"突变 体蛋白"或"蛋白突变体"是指序列中包含突变的蛋白。突变可以使用本领域已知的任何技 术来生成，包括但不限于体外定点诱变、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶 消化或者使用寡核苷酸接头等。
[0072] "嵌合蛋白"又称为"融合蛋白"，是指通过DNA重组技术获得的将两个或多个基因 重组后表达的蛋白。"截短蛋白"又称为"截短体蛋白"或"蛋白截短体"，是指通过DNA重组 技术，特异性表达蛋白中一个或多个片段的蛋白。"蛋白结构域"是蛋白分子中具有相对特 定的结构和相对独立的功能的区域。嵌合蛋白、融合蛋白或蛋白结构域可以使用本领域已 知的任何技术来生成，包括但不限于PCR扩增和重组、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制 性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。
[0073] "相同性"是指两个或多个核酸或多肽序列按照本领域常用的计算方法（例如 BLASTN或BLASTP或本领域已知的其他方法）进行比较或比对时，相同的核苷酸或氨基酸残 基的百分比。"高度同源"是指与靶标核苷酸序列或氨基酸序列比较，相同性为至少约70% 的核苷酸序列或氨基酸序列，例如相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少 约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或 100%〇
[0074] 本申请包括与本申请BKT高度同源的核苷酸序列和氨基酸序列。根据本申请的某 些实施方式，所述BKT是雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)的HpBKT。根据本申请的 某些实施方式，所述HpBKT的基因序列包含NCBI数据库中注册号是D45881. 1的序列。根据 本申请的某些实施方式，所述HpBKT的氨基酸序列包含NCBI数据库中注册号是BAA08300. 1 的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpBKT的基因序列是NCBI数据库中注册号是 D45881. 1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpBKT的氨基酸序列是NCBI数据库中 注册号是BAA08300. 1的序列。
[0075] 根据本申请的某些实施方式，与本申请HpBKT高度同源的核苷酸序列是指与本申 请HpBKT核苷酸序列的相同性为至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少 约90 %、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %、至少约99 %或100 %的核苷 酸序列。根据本申请的某些实施方式，与本申请HpBKT高度同源的氨基酸序列是指与本申 请HpBKT氨基酸序列的相同性为至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少 约90 %、至少约95 %、至少约96 %、至少约97 %、至少约98 %、至少约99 %或100 %的氨基 酸序列。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是BKT的突变蛋白。根据本申请的某些实 施方式，所述BKT是BKT的嵌合蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是具有BKT酶 活性的截短蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是具有BKT酶活性的蛋白结构域。
[0076] 本申请包括与本申请CHYB高度同源的核苷酸序列和氨基酸序列。根据本申请的 某些实施方式，所述CHYB是雨生红球藻（Haematococcus pluvialis)的HpCHYB。根据本申 请的某些实施方式，所述HpCHYB的基因序列包含NCBI数据库中注册号是AY187011. 1的序 列。根据本申请的某些实施方式，所述HpCHYB的氨基酸序列包含NCBI数据库中注册号是 AA053295. 1的