多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及半抗原、抗原、抗体及其制备方法，特别设及一种多效挫半抗原、抗原、 抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物生长调节剂（PlantGrowthRegulator)是一类具有植物激素活性的人工合 成农药，可用于调节果蔬的生长和胆藏，在农业生产过程中提高农产品产量和质量发挥着 重要作用。多效挫是20世纪70年代末英国化学公司研制开发的植物生长调节剂，是一种 高效低毒的生长延缓剂，它能够降低赤霉素和吗I噪乙酸的含量，增加乙締的释放量，提高抗 倒伏、抗旱等抗逆性，增加产量，改善作物品质。然而随着科学技术的进步，有关植物生长调 节剂安全性的报道越来越引起世界各国普遍关注。研究发现，多效挫在±壤中残留半衰期 较长，可能对非目标物产生危害，因此很多国家对多效挫在农产品中的残留量有严格的限 量标准。
[0003] 目前，欧盟、澳大利亚、日本、韩国、新加坡等国均已制定果蔬中多种植物生长调节 剂的限量。其中，欧盟规定蔬菜、水果（除葡萄）、葡萄中多效挫的限量分别为〇.〇2mg/kg、 0. 5mg/kg、0. 05mg/kg;澳大利亚规定各类热带和亚热带水果（除鳄梨和芒果）、鳄梨、芒果、 大麦和小麦中多效挫的限量分别为0.01mg/kg、0.lmg/kg、lmg/kg、0.Img/kg;日本规定桃、 苹果、香蕉中多效挫的限量分别为0. 2mg/kg、0. 5mg/kg、0.Olmg/kg;韩国规定桃、杏、李子 和樓桃中多效挫的限量为0. 〇5mg/kg，苹果中多效挫限量为0. 5mg/kg;新加坡规定鳄梨和 核果中多效挫的限量为0.Olmg/kg。我国食品安全国家标准GB2763-2014(食品中农药最 大残留限量）对多效挫残留量的规定如下：稻谷、小麦、花生仁、菜巧油、苹果、慕枝中多效 挫的限量为0. 5mg/kg，油菜巧中多效挫的限量为0. 2mg/kg。
[0004] 传统的多效挫残留分析方法，主要是依靠液相色谱法、气相色谱法或质谱法等仪 器分析方法，检测仪器昂贵，运些检测方法虽然能够满足限量检测的需要，但存在操作过程 繁琐复杂、成本较高、分析速度慢等问题，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫分析，由于 在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量 大的优点弥补了理化分析的不足，在化合物残留检测中起着越来越重要的作用。 阳〇化]影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，运些性质又决定于 免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小 分子化合物残留快速检测技术最基础和最关键的步骤。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种高免疫原性的多效挫人工半抗原、抗原并获得抗体。 同时达到制备方法重复性好、易于标准化及可保证无限量供应的目标。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供了一种多效挫半抗原，其特征在于，所述多效挫半抗 原具有如下结构式：
[0008]
[0009] 本发明还提供了所述多效挫半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010] S1、按1:1的摩尔比称取多效挫和4-(漠甲基）苯甲酸，(TC溶于四氨巧喃中；向所 得四氨巧喃溶液中加入氨化钢，冰浴下揽拌30~60min后，室溫下揽拌30~60min;加入 舰化钟反应，加热回流10~1她；所述多效挫与四氨巧喃的质量体积比为1:20g/ml，所述多 效挫与氨化钢的质量比为10:3,所述多效挫与舰化钟的质量比为（15~20) :1 ;
[0011] S2、将步骤S1得到的反应液冷却至室溫，加水后，加入2mol/L的盐酸调节抑至5 ; 60~70°C旋蒸除四氨巧喃；所述水的加入量为步骤S1所述多效挫质量的10倍；
[0012] S3、用乙酸乙醋萃取步骤S2得到的有机相3~5次；将得到的萃取相通过无水硫 酸钢干燥，直至溶剂完全挥干；
[0013] S4、将步骤S3得到的残留物用沸程为60~90°C的石油酸与乙酸乙醋按体积比 4:1配制成的淋洗液淋洗过硅胶柱；而后，将淋洗液浓缩至多效挫加入量的0. 5~0. 7倍， 所得浓缩液即为多效挫半抗原；所述硅胶柱规格为30g，25cm。
[0014] 本发明所制得的多效挫半抗原为将多效挫进行结构改造得到的簇基化多效挫化 合物，在多效挫的径基上引入活性官能团结构，既最大程度保留了多效挫的特征结构，又具 有可W与载体蛋白发生偶联的活性基团。
[0015] 本发明提供了一种多效挫抗原，其特征在于，所述多效挫抗原具有如下结构式：
[0016]
[0017] 式中：Protein为载体蛋白。
[0018] 本发明还提供了所述多效挫抗原的制备方法，其特征在于，多效挫半抗原与载体 蛋白通过氨基与簇基的缩合反应偶联，即得到多效挫抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、 卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
[0019] 优选方式下，所述多效挫抗原的制备方法包括如下步骤：
[0020] T1、称取所述多效挫半抗原，溶解于无水二氧六环试剂中，加入1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐巧DC·肥1)、N-^基班巧酷亚胺（N服），室溫下揽拌反应6个小 时，得到溶液A，备用；所述多效挫半抗原、无水二氧六环试剂、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐巧DC·肥1)与N-径基班巧酷亚胺（N服）的质量体积比为5~20mg: 1~ 2. 5ml:60 ~120mg:40 ~60mg;
[0021] 称取载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到溶液B，备用；所述载体蛋白与碳酸盐缓 冲液的质量体积比为20~lOOmg:3~15ml;
[0022] T2、将步骤T1得到的溶液A按所述多效挫半抗原与载体蛋白质量比5~20:20~ 100的比例加入到溶液B中，室溫揽拌10~1她，装入透析袋，在PBS缓冲液中4°C透析72 小时，中间置换所述缓冲液6次；SOOOrmp离屯、30min，得到的上清液即为多效挫抗原溶液；
[0023] 步骤T1所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
[0024] 本发明制得的多效挫抗原中，多效挫半抗原与载体蛋白的偶联比为8~11:1，所 述偶联比为摩尔比。
[00巧]本发明所述多效挫人工抗原可W作为免疫原也可W作为检测用包被原。
[00%] 本发明还提供了多效挫抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体通过将所述多效 挫抗原刺激动物机体免疫应答获得。
[0027] 优选方式下，所述抗体为多效挫多克隆抗体。
[0028] 优选方式下，所述抗体为多效挫单克隆抗体。
[0029] 本发明的优点在于：
[0030] 通过化学合成多效挫免疫抗原，对小鼠进行免疫，制备得到高度均质、纯度高、专 一性强的抗多效挫单克隆抗体，制备方法具有重复性好、易于标准化及可保证无限量供应 等优势。
【附图说明】 阳03U 图1为多效挫人工抗原的SDS-PAGE图。
[0032] 图2为单克隆抗体的标准曲线。
【具体实施方式】
[0033]W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平 均值。
[0034] 实施例中所用的PBS缓冲液均为抑7.4、0.Olmol/L的PBS缓冲液。实施例中所用 的碳酸盐缓冲液均为pH9. 6、0.05mol/L的碳酸钢缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA，卵清蛋白 简称OVA，钥孔血蓝蛋白简称KLH。
[0035] 多效挫，如式（1)所不，购自Sigma-Al化ich公司，分子量为293. 79。
[0036]
阳037]式（1)
[0038] 4-(漠甲基）苯甲酸，式似所示，购自Sigma-Al化ich公司，分子量为214. 0366。
[0039]
W40] 式似
[00川实验用Ba化/c小鼠和新西兰白兔由大连医科大学实验动物中屯、提供。
[0042] 实施例1、制备多效挫半抗原
[0043] 称取1.Og多效挫和0.73g4-(漠甲基）苯甲酸，在0°C下，溶解于20血四氨巧喃 中，向溶液中加入0. 3g氨化钢，冰浴下揽拌30min。然后室溫下继续揽拌30min后，加入 〇.〇56g舰化钟后，加热回流1她。上述反应液冷却到室溫并缓慢加入lOmL蒸馈水，2M肥！ 调抑到5,旋转蒸发除去大部分四氨巧喃，用乙酸乙醋萃取有机相Ξ次，乙酸乙醋提取 物经无水硫酸钢干燥后，溶剂被完全挥干。残留物用石油酸化0-90°C)-乙酸乙醋（4:1，V/ V)淋洗过硅胶柱（30g，25cm)。淋洗液浓缩至0.7g，即为多效挫半抗原。 W44] 实施例2、制备多效挫人工抗原
[0045] 1、多效挫免疫原的制备
[0046] 取8mg实施例1制备得到的多效挫半抗原所示化合物，溶解于1. 0ml无水二氧 六环试剂中，分别加入90mg1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐巧DC.肥1)， 53. 5mgN-径基班巧酷亚胺（N服），室溫下揽拌反应6个小时，得到多效挫的活化液；称取载 体蛋白BSA20mg溶于3mL碳酸盐缓冲液中；向BSA溶液中缓慢加入多效挫活化液，室溫下 磁力揽拌1她，装入透析袋，在PBS缓冲液中4°C透析72小时（中间置换缓冲液6次），然后 于SOOOrmp离屯、30min，取上清即为多效挫抗原溶液（多效挫免疫原溶液）；将得到多效挫 抗原溶液分装于安培瓶中，-20°C保存。偶联BSA的多效挫免疫原简称PBZ-BSA，其溶液简 称PBZ-BSA溶液。
[0047] 用同样的方法可W制备多效挫的偶联物PBZ-KLH，或PBZ-0VA。
[0048] 上述方法制备的多效挫偶联物同样可W作为多效挫的包被原。
[0049] 将PBZ-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式 计算稀释液中的蛋白的浓度，乘W稀释倍数后即为PBZ-BSA溶液中的PBZ-BSA浓度。蛋白 质浓度（mg/ml) = 1.45X0D280-0. 74X0D260。
[0050] 2、多效挫免疫原的表征
[0051] 将PBZ-BSA溶液用PBS缓冲液稀释（使PBZ-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲； 将含5mg/mL多效挫的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mLBSA的PBS缓冲液作为溶液丙。 分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外（200-380nm)光谱扫描，分别采用溶液乙和溶液 丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系 数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除W分子量得到该化合物的摩尔浓度， 计算偶联比，簇基化的多效挫半抗原和BSA的偶联比为10:1，即10个多效挫半抗原所示化 合物结合1个BSA。
[0052]SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，浓缩胶浓度为5 %，分离胶浓度为12 %，浓缩胶电压60V， 分离胶电压80V，上样量为2μg，考马斯亮蓝染色3~地后，置脱色液中过夜脱色。根据条 带分子量的大小变化判断偶联效果。
[0053] SDS-PAGE电泳结果表明，如图1所示，BSA的泳动速度大于PBZ-BSA，即PBZ-BSA的 分子量大于