BSA，证明PBZ已偶联上BSA。
[0054] 实施例3、多效挫单克隆抗体的制备 阳化引 Ba化/c小鼠：购于大连医科大学实验动物中屯、；
[0056] SP2/0-Agl4 小鼠骨髓瘤细胞，ATCCC化-8287?。
[0057] 一、动物免疫
[0058] 将实施例2制备的PBZ-KLH溶液通过足垫注射方法免疫Ba化/c小鼠，每只小鼠单 次免疫10μgPBZ-KLH，共免疫10周，每周两次。
[0059] 二、细胞融合与克隆化
[0060] 1、最后一次免疫3天后，选择血清效价和特异性最优的小鼠，分离小鼠順窝淋己 结B细胞，按5:1 (数量配比）比例与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合，选择性培养基筛选融合 细胞，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。
[0061] 2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到一株可W分泌多效挫单克隆抗体的 杂交瘤细胞，命名为抗多效挫单克隆抗体杂交瘤细胞5AF3 (简称杂交瘤细胞5AF3)。 阳06引 S、细胞冻存和复苏
[0063] 用冻存液将杂交瘤细胞5AF3制成1X1〇6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。 复苏时，取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离屯、去除冻存液后移入培养瓶内培养。
[0064] 四、单克隆抗体的制备与纯化 W65] 1、增量培养法 阳066] 细胞培养基的制备方法：向DMHM培养基中添加胎牛血清和碳酸氨钢，胎牛血清的 终浓度为20% (质量百分含量），碳酸氨钢的终浓度为0.2% (质量百分含量）。 阳067] 将杂交瘤细胞5AF3置于细胞培养基中，37°C培养2天，收集培养液备用。用辛 酸-饱和硫酸锭法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体（-20°C保存）。
[0068] 2、腹水制备
[0069] 取成年Ba化/c小鼠，于接种杂交瘤细胞前一周腹腔注射降植烧致敏，每只注射 0. 5mL，一周W后，将准备好的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠，每只0. 5mL，细胞量为1X106个，腹 水的产生需1-2周，期间密切观察小鼠，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集 腹水。
[0070] 抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，細紧腹部皮肤，另一只手将针头刺入腹腔 1-2畑1，针头刺入时应选择右下腹或左下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管。在 针头刺入前，先确保针的尾部已对准lOmL塑料离屯、管，流出的腹水可直接滴入离屯、管中， 再3000巧m离屯、lOmin，收集上清液，分装，-20°C冻存备用。
[0071] 腹水的纯化：采ProteinA柱法纯化腹水。1血腹水加入2血0. 06mol/LpH4.8的 醋酸钢缓冲液，滴加33μL的辛酸，4°C静置2-4h后6000巧m4°C离屯、30min，收集上清液， 按上清液与等体积的2XPBS缓冲液混合，缓慢加入层析柱中，用10倍柱体积W上的PBS洗 涂，至流出液无蛋白检出。用0.lMpH3. 0的甘氨酸洗脱。测定抗体浓度。使用Millipore 蛋白浓缩管浓缩，分装后于-20°C冻存备用。
[0072] 单克隆抗体中的蛋白质浓度（mg/ml) = 1.45X0D280-0. 74X0D260。
[0073] 采用W上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为18. 5mg/ml。
[0074] 五、单克隆抗体的检测
[0075] 将步骤四得到的抗血清进行如下检测：
[0076] 1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒（Sigma公司产品）检测单克隆抗体的 亚型，结果如下表，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgGl。
[0077]
阳07引 2、利用间接化ISA法测定抗体效价 阳0巧](1)用PBZ-BSA作为包被原包被酶标板
[0080] 采用实施例2制备的PBZ-BSA溶液（用碳酸盐缓冲液稀释）进行包被，100μL/ 手L;分别设置W下PBZ-0VA包被浓度：1μg/mL、0. 5μg/mL、0. 25μg/mL、0. 125μg/血。
[0081] 似4°C解育16小时。 阳0間 做封闭并洗板。 阳〇8引 （4)加一抗海孔中先加入100μLPBS缓冲液，然后用1:500稀释的抗血清（腹 水）从第一孔开始做倍比稀释，浓度依次为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、 1:32000(W此类推）倍比稀释，每种稀释液设置Ξ个复孔，设空白对照孔。
[0084] (5)室溫解育化，洗板。 阳0化](6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室溫解育化。
[0086] (7)洗板。
[0087] (8)加入TMB显色液，避光显色lOmin。
[0088] (9)每孔加入100μΙ2mol/L硫酸中止反应；读0D450nm值。选0D450nm达到 1.0-1. 5时的抗血清的最大稀释倍数为抗体的效价。
[0089] 采用间接化ISA测定腹水效价，结果如下表所示。当腹水稀释度为1:25000时， 0D450为1. 091，故腹水的效价为1:25000。
[0090]
[0091] 3、单克隆抗体IC50测定
[0092] 采用阻断化ISA鉴定其敏感性及ICjt。步骤和效价测定相似，不同处在于第1 步加〇〇45。值为1. 0的抗体50μL和不同浓度的PBZ标准品溶液50μL作为抑制剂，即测定 抗体对不同浓度ΡΒΖ的抑制率。W吸光率度/Β。）度。为ΡΒΖ标准品浓度为0时吸光值，Β为 ΡΒΖ标准品不同浓度的吸光值）为纵坐标，W不同浓度ΡΒΖW10为底的对数值为横坐标，绘 制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算单克隆抗体对ΡΒΖ的ICw。从图2可知，本例中 单克隆抗体对PBZ的ICs。值为17.8ng/ml。
[0093]本发明制得的单克隆抗体可进一步运用到免疫传感器、胶体金免疫层析法等技术 的构建。由于免疫分析方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携进行现场监测， 克服了传统检测方法的缺点。因此该发明具有广阔的应用前景。
[0094] 实施例4、多效挫多克隆抗体制备
[00巧]新西兰大白兔：购于大连医科大学实验动物中屯、。
[0096] 将4月龄新西兰大白兔W实施例2制备的PBZ-KLH溶液进行免疫（免疫方式为 颈背部皮下多点注射）。初次免疫为1.Omg/只，二免、Ξ免、四免剂量为0. 5mg/只，共免疫 4次。首免，用无菌PBS稀释人工抗原与等量弗氏完全佐剂（FCA)混合，25000r/min充分 乳化5min;3周后加强免疫，用无菌PBS稀释人工抗原与等量弗氏不完全佐剂（FIA)混合， 250(K)r/min充分乳化5min，免疫间隔2周。期间各在Ξ免和四免后的第7天，耳静脉采血 1血，ELISA检测抗血清效价。4次免疫lOd后，颈动脉采全血，用PBS稀释100倍，300化/ min离屯、15min，弃沉淀，上层清液即为多克隆抗体溶液，置于-20°C保存。
[0097]W上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加W等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种多效唑半抗原，其特征在于，所述多效唑半抗原具有如下结构式：2. 权利要求1所述多效唑半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 按1:1的摩尔比称取多效唑和4-(溴甲基）苯甲酸，(TC溶于四氢呋喃中；向所得四 氢咲喃溶液中加入氢化钠，冰浴下搅拌30~60min后，室温下搅拌30~60min ;加入碘化 钾反应，加热回流10~18h ;所述多效唑与四氢呋喃的质量体积比为1:20g/ml，所述多效唑 与氢化钠的质量比为10:3,所述多效唑与碘化钾的质量比为（15~20) :1 ; 52、 将步骤Sl得到的反应液冷却至室温，加水后，加入2mol/L的盐酸调节pH至5 ;60~ 70°C旋蒸除四氢呋喃；所述水的加入量为步骤Sl所述多效唑质量的10倍； 53、 用乙酸乙酯萃取步骤S2得到的有机相3~5次；将得到的萃取相通过无水硫酸钠 干燥，直至溶剂完全挥干； 54、 将步骤S3得到的残留物用沸程为60~90°C的石油醚与乙酸乙酯按体积比4:1配 制成的淋洗液淋洗过硅胶柱；而后，将淋洗液浓缩至多效唑加入量的〇. 5~0. 7倍，所得浓 缩液即为多效唑半抗原；所述硅胶柱规格为30g，25cm。3. -种多效唑抗原，其特征在于，所述多效唑抗原具有如下结构式：式中：Protein为载体蛋白； 所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。4. 根据权利要求3所述多效唑抗原，其特征在于，所述多效唑抗原为免疫原或检测用 包被原。5. 权利要求3所述多效唑抗原的制备方法，其特征在于，多效唑半抗原与载体蛋白通 过氨基与羧基的缩合反应偶联，即得到多效唑抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白 蛋白或钥孔血蓝蛋白；。6. 根据权利要求5所述多效唑抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： T1、称取所述多效唑半抗原，溶解于无水二氧六环试剂中，加入1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC .HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，室温下搅拌反应6个小 时，得到溶液A，备用；所述多效唑半抗原、无水二氧六环试剂、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐（EDC ^HCl)与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的质量体积比为5~20mg: 1~ 2. 5ml: 60 ~120mg: 40 ~60mg ; 称取载体蛋白溶于碳酸盐缓冲液中，得到溶液B，备用；所述载体蛋白与碳酸盐缓冲液 的质量体积比为20~IOOmg:3~15ml ; T2、将步骤Tl得到的溶液A按所述多效唑半抗原与载体蛋白质量比5~20:30~100 的比例加入到溶液B中，室温搅拌10~18h，装入透析袋，在PBS缓冲液中4°C透析72小时， 中间置换所述缓冲液6次；8000rmp离心30min，得到的上清液即为多效唑抗原溶液； 步骤Tl所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。7. -种权利要求3所述多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体通过将所述多 效唑抗原刺激动物机体免疫应答获得。8. 根据权利要求7所述多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体为多效唑单克 隆抗体。9. 根据权利要求7所述多效唑抗原制备的抗体，其特征在于，所述抗体为多效唑多克 隆抗体。
【专利摘要】本发明涉及半抗原、抗原、抗体及其制备方法，特别涉及一种多效唑半抗原、抗原、抗体及其制备方法。本发明多效唑人工抗原为将多效唑进行结构改造得到的化合物，在多效唑的羟基上引入活性官能团结构，既最大程度保留了多效唑的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。本发明多效唑人工抗原制备的抗体为将多效唑人工抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。将本发明多效唑人工抗原免疫动物，可获得高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，方法简便、易行。
【IPC分类】C07K1/10, C07K16/44, C07K14/795, C07K14/77, C07D249/08, C07K14/765, C07K1/02
【公开号】CN105348206
【申请号】CN201510756126
【发明人】王秋艳, 程根武, 张宁, 秦朝秋
【申请人】王秋艳
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月9日