1X10^只的A549细胞接种的裸鼠背部皮下。
[0209] (3)两周左右能看到明显的肿瘤长出时，将裸鼠随机分组，每组8只，抗体按 500μg/只的剂量进行腹腔注射治疗，WPBS作为对照，每隔Η天治疗一次并测量肿瘤体 积，治疗持续一个月时间。裸鼠肿瘤体积大小；V= 0. 5XaXb2,a为肿瘤实体长直径，b为 肿瘤实体短直径。
[0210] (4)实验结束时将肿瘤取下，去皮后称重。
[0211] 结果如图3所示，图3A显示了结果如图3所示，图3A显示了持续治疗时各组的肿 瘤体积，图3B显示了治疗结束后取出肿瘤的重量；从图3中可W看出抗体927、抗体993、抗 体1044、抗体1050可W显著地抑制肿瘤的生长，4个抗体的肿瘤抑制率> 65% 。21引 连施例8、肥R3单杭与西耍昔单杭协同抑制A431细胸牛长
[0213] 处于对数期生长的A431细胞（人头颈部表皮癌细胞系，购自中国科学院细胞库）， 膜酶消化后计数，用含有1%FBS的DF/12培养基调整细胞密度到20000个细胞/ml,将稀 释好的细胞W200ul/孔的量铺到96孔板中，37°C，5% (?培养24小时。之后选取96孔板 中间的8排4列32个孔，分成8组，每组4个重复，对应加入不同浓度的单抗，单独作用组， 肥R3单抗终浓度共六个梯度，分别为12. 5ug/ml，6. 25ug/ml，3. 12加g/ml;西妥昔单抗终浓 度为加g/ml，协同作用组肥R3单抗与西妥昔单抗浓度减半混合。对照组中不加入任何抗 体。37°C，5%C〇2培养4到5天，之后用CellCountingKit-8 (CCK-8)细胞增殖-毒性检 测试剂盒（购自同仁化学）检测细胞活性，细胞活性与0D450读数正相关。
[0214] 实验结果如图4所示，从图中可W看出将肥R3抗体与西妥昔单抗联用，产生了 协同效果，1044抗体与西妥昔单抗联用，与单用西妥昔相比，抑制细胞生长的活性提高了 38%。927抗体与西妥昔单抗联用，与单用西妥昔相比，抑制细胞生长的活性提高了 32%。 993抗体与西妥昔单抗联用，与单用西妥昔相比，抑制细胞生长的活性提高了 16%。1050抗 体与西妥昔单抗的协同效果较不明显。而且，使用本发明的抗体和西妥昔单抗联用可W显 著降低西妥昔的用量。 邮1引 连施例9、肥R3单杭可巧区編码序列的克降巧鉴定
[0216]W实施例1中筛选所得肥R3杂交瘤细胞株cDNA为模板，利用PCR技术，克隆肥R3 鼠源单抗可变区基因；经测序，选取无突变无终止密码子的序列，采用5'RACE技术克隆出 功能性Vl和Vh基因。
[0217] 一、肥R3鼠源单抗可变区编码序列的克隆
[0218](一）从杂交瘤细胞株中提取肥R3单抗的总RNA
[0219] 用上海飞捷生物公司FAST1000试剂盒提取。
[0220] (1)取4X105杂交瘤细胞，100化pmX3min，弃上清。用PBS洗涂一次。将细胞重 悬于100μ1PBS中，放入离必管内。
[0221] (2)加入RB1液1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。
[0222] (3)加入RB2液500μ1，充分颠倒混匀Imin。将混匀后的液体吸入或直接倒入内 套管中离必Imin。
[0223] (4)弃去外套管中液体，内套管中加入500μ1洗液，离必Imin，再重复一次。
[0224] (5)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离必Imin。
[0225] (6)将内套管移入新的离必管中，在膜中央加入洗脱液40μ1，室温静置Imin，获 得总RNA。
[0226] (W上枪头、离必管和无菌水均用DEPC处理，经12rC灭菌20min。）
[0227] (二）RT-PCR制备肥R3鼠源单抗cDNA
[022引 队总RNA为模板，Oligo(dT) 18为引物，RT-PCR扩增肥R3单抗cDNA。反应体系和 步骤如图3所示。
[0229] (Η)肥R3鼠源单抗可变区基因的克隆
[0230]A、兼并引物的合成
[0231] 根据抗体信号肤及骨架区基因的保守性，设计并合成W下兼并引物（W下引物中 W=A/T,K=G/T,R=A/G,Y=C/T,Μ=A/C,S=C/G,Ν=C/G/T,V=A/C/G)：
[0232] (1)轻链上游可变区兼并引物：根据信号肤序列设计（5' -3')
[0233]
[0234] 根据FR1保守序列设计巧'-3')
[023引MKac-FwdGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQIDNO. :78)
[023引 似轻链下游兼并引物巧' -3'）
[0237]MKac-RevGGATACAGTTGGTGCAGCATC(SEQIDNO. :63)
[023引（3)重链上游兼并引物；根据信号肤序列设计（5' -3')
[0239]
[0240] (4)重链上游兼并引物；根据FR1保守序列设计巧'-3')
[0241]
[0242] (5)重链下游兼并引物
[0243]Μ肥C-RevATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(沈QIDNO. :79)
[0244] B、可变区基因的克隆
[024引W上述兼并引物和已制备肥R3单抗cDNA为模板，PCR扩增肥R3鼠源单抗可变区 基因。
[0246] (1) PCR体系和参数设置如下：
[0247]
[024引 PCR参数设置；95°C，预变性，5min;30轮如下循环；95°C变性，0. 5min，65°C复性， 0. 5min，72°C延伸，0. 5min;72°C延伸，lOmin。
[0249] (2)用1 %的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，并与DM分子量标记LD2000判 断扩增片段的大小（如图4所示）。结果显示；分别有5条兼并引物扩增出轻链可变区基 因，有4条兼并引物扩增出重链可变区基因，其大小约为330bp左右，条带单一，与轻/重链 可变区基因片段的理论大小基本一致。
[0250] 采用博大泰克公司的胶回收试剂盒回收330bp处的单抗可变区PCR扩增片段，并 连接于pMDlST克隆载体（购自Takara公司）上，转化入D册α大肠杆菌感受态细胞中，进 行藍白斑筛选，将阳性克隆送Invitrogen公司测序验证。
[0巧1] 根据NCBII浊LAST化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析 结果，筛选出功能性抗体可变区基因，设计抗体轻链和重链可变区下游引物：
[0252]采用5' RACE扩增出可变区5'端的序列。最终获得肥R3单抗的功能性可变区基 因。
[0巧3] 得到的抗体基因序列及对应氨基酸序列如下。其中下划线部分表示CDR区。
[0巧4] 927H可变区基因序列如（SEQIDNO. :1所示。
[0巧5] 927H可变区氨基酸序列为 阳256] EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIFPRSGHTNYNEKFKGKAT LTADTSSSTAYMQVS化TS邸SAVYFCARS畑YYGTNAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO. :2)。
[0巧7] 92化可变区基因序列如沈QIDNO. :3所示。
[0巧引 92化可变区氨基酸序列为 阳259] DIVMTQSPS化TVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQ服PGQPP化LIYWASTRESGVPDRFT GSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(沈QIDNO. :4)。
[0260] 927抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：
[0261]
[026引927抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：
[0263]
[0264]
[026引1044H可变区基因序列如沈QIDNO. :5所示。
[0266] 1044H可变区氨基酸序列为
[0267]EVQLQQSGTELMKPGASVKISCKATGGTFSNYWIDWVKQRPG服LEWIGEILPGSGGTDY肥KFKGKAT FTADTSSNTAYMQLS化TS邸SAVYYCAR迎迎YEMWGQGTLVTVSS(SEQIDNO. : 6)。
[026引104化可变区基因序列如沈QIDNO. : 7所示。
[0269] 104化可变区氨基酸序列：
[0270] DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSK化L服NGITYLYWYLQKPGQSPQ化IYQMSNLASGVPDRFSS SGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQ边玉LEI1FGGGTKLEIKR(沈Q ID NO. : 8)。
[027。 1044抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：
[0272]
[027引 1044抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：
[0274]
[027引 993H可变区基因序列如沈Q ID NO. :9所示。
[0276] 993H可变区氨基酸序列： 阳277] EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYSLSWVRQTP邸化EWVASITFGGTAYYSDSVKGRFTI S畑NARNILYLQMSSLK沈DTAMYYCVRGDGYEDPMDYWGQGTSVTVSS(沈Q ID NO. :10)。
[027引 99化可变区基因序列如沈Q ID NO. : 11所示。
[0279] 99化可变区氨基酸序列： 阳280] DIVMTQTTVSLAV化GQRATISCRA沈SVDSYGKSFMHWYQQKPGQPP化LIYRASNLESGIPARFSGS GSRTDFTITINPVEA孤VSTYYCQQS肥DPYTFGGGTKLEIR(沈Q ID NO. :12)〇[02引]993抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：
[0282]
[0283] 993抗体轻链可变区中，各FR和CDR如下：
[02841
[028引 1050H可变区基因序列如沈QIDNO.
:13所示。
[0286] 1050H可变区氨基酸序列： 阳287] QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQ化EWIGWIFPGSGHTKC肥NFKAKAT LTADTSSSTAYMQLS化TS邸SAVYFCARS畑YYGSNAVDYWGQGTSVTVSS(沈QIDNO. :14)〇[028引 105化可变区基因序列如沈QIDNO. : 15所示。
[0289] 105化可变区氨基酸序列： 阳290] DIVMTQSPS化TVTAGEKVTMSCKSSQS化NSGNQKNYLTWYQ服PGQPP化LIYWASTRESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPYTFGGGTKLEIKR(沈QIDNO. :16)
[02W] 1050抗体的的重链可变区中，各FR和CDR如下：
[0292]
阳29引 连施例10、肥R3人-鼠嵌合单克降杭体直核表汰裁体的构律
[0296] 利用重叠PCR技术将轻链\基因与人Ig的基因进行拼接，构成轻链嵌合基 因；轻链5'端引入BamHI限制性内切酶位点，轻链3'端引入EcoRI限制性内切酶位点。同 理，构建重链嵌合基因。分别将上述轻链/重链基因插入PCDNA3. 1(+/-)表达载体（购自 Invitrogen公司）的单克隆酶切位点，构建肥R3人-鼠嵌合抗体的表达载体