在无血清悬浮细胞培养系统中生产重组慢病毒载体的可扩大的制造方法
【专利说明】在无血清悬浮细胞培养系统中生产重组慢病毒载体的可扩大的制造方法
相关申请的信息
[0001]本申请要求2013年3月15日申请的申请序列号61/787，818的优先权，该申请通过引用全部明确地并入本文。
技术领域
[0002]本发明涉及分子生物学和基因治疗领域。更具体地，本发明提供了大规模生产病毒载体(优选慢病毒载体和与腺相关病毒载体)的改进的方法，包括编码医疗用途的医学有益产物的转基因。
【背景技术】
[0003]整个说明书中引用了几篇出版物和专利文件，以描述本发明所属领域的状态。这些引用文献的每篇引用通过引用并入本文，如同完整说明。
[0004]已经研制并广泛地使用基于重组慢病毒(rLenti)的载体作为用于几种严重的人类疾病的实验基因递送产物。由于慢病毒载体具有能够感染复制细胞和非复制细胞(包括干细胞)的能力，已经证明慢病毒载体在转导方面非常多产。
[0005]已经开始了世界范围的使用基于HIV-1的VSVG假型慢病毒载体的许多临床试验，并观察到了非常有希望的临床优点。然而，同时在该领域中显著的问题是缺少制造后期临床研究需要的足够量的rLenti的方法。研究和临床实验数据显示了 rLenti载体是用于针对例如原发性免疫缺陷病的基因疾病的人类基因治疗(Fischer and colleauges)以及针对癌症的免疫治疗(June and colleagues)的有希望的基因递送载体。
[0006]然而，在该领域中的关键需求是开发适于大量的rLenti载体的cGMP制造的大规模生产和纯化方法，满足生产能力和临床实验的产品品质要求，以支持后期阶段的临床应用。例如，对于leukemias治疗的I期研究中的一种非常有前途的方法，对于III期研究和早期的授权产品的推出，预期需要相对于目前可用的方法的至少100倍的更高的制造能力。因此，急切地需要可放大生产该基因治疗载体的方法。
【发明内容】
[0007]根据本发明，提供了在可扩大的无血清的悬浮细胞培养基中生产高滴度rLenti载体的方法及使用可扩大的、工业标准的柱层析技术纯化所述载体的方法。可制造包含根据所述方法生产的并可选地包含在药学可接受载体中的rLV颗粒的rLV载体制剂。
[0008]在一实施方式中，用于病毒载体纯化的方法包括:a)从无血清悬浮培养基收获重组病毒载体，所述重组病毒载体包括转基因；通过过滤澄清步骤a)的收集物；c)收获步骤b)的滤液，并且可选地核酸酶酶切所述滤液，以去除DNA/RNA杂质；使步骤c)的滤液经过PEG调节的亲和层析或离子交换柱层析，从而分离所述病毒载体；通过切向流过滤进一步纯化从步骤d)获得的病毒载体，以减小体积和缓冲液更换；使步骤e)的滤液经过尺寸排阻柱层析，以进一步纯化所述病毒载体；使步骤f)的载体经切向流过滤，从而获得最终的载体滴度；通过过滤器过滤步骤g)获得的载体溶液，以及收集所述纯化的病毒载体。
[0009]在另一实施方式中，用于病毒载体纯化的方法包括:a)从无血清悬浮培养基收获包含转基因的重组的病毒载体山)通过过滤澄清步骤a)的收集物；c)使步骤b)所述的澄清的悬浮液经切向流过滤，以减小体积和更换缓冲液；d)收获步骤c)的滤液，并且可选地核酸酶酶切所述滤液，以去除DNA/RNA杂质；e)使步骤d)的滤液经过PEG调节的亲和层析或离子交换柱层析，从而分离所述病毒载体；f)使步骤e)获得的病毒载体经过尺寸排阻柱层析，以进一步纯化所述病毒载体；g)使步骤f)的载体经切向流过滤，从而获得最终的载体滴度；h)通过过滤器过滤步骤g)获得的载体溶液；以及i)收集所述纯化的病毒载体。
[0010]在另一实施方式中，用于病毒载体纯化的方法包括:a)从无血清悬浮培养基收获包含转基因的重组的病毒载体山)通过过滤澄清步骤a)的收集物；c)使步骤b)所述的澄清的悬浮液经切向流过滤，以减小体积和更换缓冲液；d)收获步骤c)的滤液，并且可选地核酸酶酶切所述滤液，以去除DNA/RNA杂质；e)使步骤d)的滤液经过PEG调节的亲和层析或离子交换柱层析，从而分离所述病毒载体；f)通过切向流过滤进一步纯化从步骤e)获得的病毒载体，以减小体积和更换缓冲液；g)使步骤f)的滤液经过尺寸排阻柱层析，以进一步纯化所述病毒载体；h)使步骤g)的载体经切向流过滤，从而获得最终的载体滴度；i)通过过滤器过滤步骤h)获得的载体溶液，以及j)收集所述纯化的病毒载体。
[0011]本发明的方法可应用于慢病毒载体(rLV)。在具体的实施方式中，rLV载体包括重组慢病毒载体(rLV)，为!11￥-1、!11￥-2、!11￥-1/!11￥-2假型病毒、!11￥-1/31￥、？1￥、羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒、牛免疫缺陷病毒、HIV及它们的假型病毒或水疱性口炎病毒G-假型慢病毒(VSVG假型病毒)载体。
[0012]根据本发明的病毒载体包含转基因。在具体的实施方式中，所述转基因编码选自由siRNA、反义分子以及miRNA、核糖酶和shRNA组成的组中的核酸。在另外的【具体实施方式】中，转基因编码基因产物(蛋白质或多肽)。
[0013]在具体的方面，所述基因产物(蛋白质或多肽)是胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(ΕΡ0)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α (TGF-α )、血小板衍生生长因子(TOGF)、胰岛素样生长因子I和II (IGF-1和IGF-1I)、TGF-β、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)、neurturin、聚集蛋白、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白_2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、sonic hedgehog或酪氨酸轻化酶组成的组中的基因产物。在另外具体的方面，所述基因产物(蛋白质或多肽)是血小板生成素(ΤΡ0)，白细胞介素(IL 1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α、β和γ，干细胞因子，flk-2/Flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，G蛋白偶联受体(GPCR)，CCR5和I类和II类MHC分子组成的组中的基因产物。
[0014]在进一步具体的方面，所述基因产物(蛋白质或多肽)是编码用于矫正先天性代谢缺陷的蛋白质的核酸，所述蛋白选自由氨甲酰合成酶1、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α -1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子V、因子VII1、因子IX、胱硫醚-β -合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶Α脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β -葡萄糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、视网膜色素上皮细胞特异性65kDa蛋白(RPE65)、Η蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调控子(CFTR)序列或肌营养不良蛋白cDNA序列组成的组中。在进一步另外的具体方面，所述基因产物(蛋白质或多肽)是因子VIII或因子IX。
[0015]在进一步具体的方面，转基因编码肿瘤相关的抗原(TAA)。在进一步具体的方面，转基因编码 CAIX、CD19、CD20、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44v7/8、CEA、EGF-RIII (表皮生长因子受体型突变体3)EGP-2、erb-B2、erb_B2、erb_B3、erb_B4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、⑶2、Her2/neu、IL_13R_a2、KDR、k_ 轻链、LeY、LI 细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素，MUC1，NKG2D，癌胚抗原(h5T4)，PSCA，PSMA，靶向 TAA 的 mAb IgE, TAG-72 或 VEGF-R2 的任一个的基因产物。
[0016]根据本发明的病毒载体可由细胞产生。在具体的实施方式中，通过哺乳动物细胞产生重组的病毒载体。在具体的方面，重组的病毒载体由HEK 293T(ATCC)、HEK293F(LifeTechnologies)、HEK293 (ATCC)、293S(ATCC)、BHK(ATCC)、BHK-21 (ATCC)、CHO(ATCC)、CHO/dhFr-(ATCC) 1 或 CHO K1 (ATCC)细胞产生。
[0017]根据本发明的产生的重组病毒载体的细胞通常在生长培养基中悬浮生长。用于细胞的生长培养基包括无血清的细胞生长培养基。在具体的方面，无血清的生长培养基为 FreeStyle?293 (GibcoR, Life Technologies)、DMEM/F12 (GibcoR, Life Technologies)、SFM4Transfx-293(HyClone?, ThermoScientif ic)、CDM4HEK293(HyClone?,ThermoScientific)、StemPro-34SFM (GibcoR, Life Technologies)、FreeStyle F17 (GibcoR, LifeTechnologies)、293SFM 11 (GibcoR, Life Technologies)或 CD293 (GibcoR, LifeTechnologies)或其组合。
[0018]在本发明的方法中可使用核酸酶。在具体的实施方式中，核酸酶是核酸内切酶、核酸外切酶或其组合。在另外的【具体实施方式】中，核酸酶为脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或其组合。在进一步具体的实施方式中，核酸酶为全能核酸酶(benzonase)或脱氧核糖核酸酶(DNase)。
[0019]在本发明的方法中还可使用各种树脂或色层分析基质(介质)。在具体的实施方式中，可使用亲和或离子交换树脂或基质(介质)。在具体的方面，离子交换柱层析包括阴离子或阳离子交换柱层析、强或弱的阴离子交换、强或弱的阳离子交换。
[0020]本发明的方法还包括与柱层析结合的另外的结合、洗涤和/或洗脱步骤。可进行这样的结合、洗涤和/或洗脱步骤一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次)。在各种实施方式中，方法包括调节先前步骤的滤液为结合溶液(用于结合病毒到柱的树脂或介质)；和/或使滤液与亲和柱或离子交换柱接触，从而结合病毒载体到亲和或离子交换柱，和/或洗涤结合病毒载体，以用洗涤溶液去除杂质，所述溶液可选地包括PEG或PEG和盐；以及/或者用洗脱液从亲和柱或离子交换柱洗脱病毒载体。[0021 ] 在具体的方面，结合溶液包含约0% -10%重量/体积、或约0% -5%重量/体积、或约0% -2%重量/体积的PEG。在另外的具体的方面，所述结合溶液包含具有约2，OOOkDa至约40，OOOkDa的分子量的PEG。
[0022]在具体的方面，所述洗涤溶液包含约1 % -10 %重量/体积或约1 % -5 %重量/体积或约1% -2%重量/体积的PEG。在另外具体的方面，所述洗涤溶液包含具有约2，OOOkDa至约40，OOOkDa的分子量的PEG。
[0023]在具体的方面，所述洗脱液包含约0%?20%重量/体积的PEG。在另外具体的方面，所述洗脱溶液包含具有约2，OOOkDa至约40，OOOkDa的分子量的PEG。
[0024]在本发明的方法中，结合、洗涤和/或洗脱溶液可选地包含一种或多种盐。在具体的实施方式中，结合、洗涤和/或洗脱溶液包含一种或多种约20mM至约1，OOOmM(lM)的量的盐。非限制的盐包括氯化钠和/或氯化钾。
[0025]在另外的实施方式中，用于病毒载体纯化的方法包括一个或多个过滤步骤。在具体的实施方式中，通过具有约.20?0.5um的孔径的过滤器过滤。在具体的方面，通过约.20um的孔径的过滤器、.22um的孔径的过滤器或.45um孔径的过滤器过滤。
[0026]如文中公开，本发明的方法能够产生高滴度的纯化