Scientific)、StemPro-34SFM(GibcoR, Life Technologies)、FreeStyle F17(GibcoR, Life Technologies)、293SFM II (GibcoR, Life Technologies)和CD293 (GibcoR, Life Technologies)培养基。
[0057]本发明的方法中，处理或方法步骤可用于减小或减少核酸杂质的量。在具体的实施方式中，核酸酶用于减小或降低在收获或制备的重组病毒载体中核酸杂质的量。在具体的实施方式中，核酸酶为核酸内切酶(例如全能核酸酶)，核酸外切酶或它们的组合。在具体的实施方式中，核酸酶为脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或它们的组合。在具体的实施方式中，核酸酶为脱氧核糖核酸酶。
[0058]在本发明的方法中，可进行一个或多个柱层析步骤。各种物质适于用作用于柱层析的树脂或介质(固定相)。这样的树脂或介质(固定相)包括基于电荷的(离子交换)或亲和树脂或介质。
[0059]在具体的实施方式中，离子交换柱层析为阴离子(强或弱)的交换柱层析，或阳离子(强或弱)的交换柱层析。在更具体的实施方式中，离子交换柱为基于季铵化聚乙烯亚胺的树脂或介质；或基于季铵的树脂或介质。在进一步更具体的实施方式中，离子交换柱为基于聚乙烯亚胺的树脂；基于二乙氨基乙基(DEAE)的树脂；或基于二乙氨基丙基的树脂。
[0060]在具体的实施方式中，亲和柱为基于磺丙基的树脂或介质，或基于羧甲基的树脂或介质。在另外具体的实施方式中，亲和柱为多官能层析树脂或介质；金属螯合亲和树脂或介质、基于肝素的树脂或介质，或基团特异的亲和树脂或介质。
[0061]适于本发明的方法中的柱层析的另外的树脂或介质包括基于羟基磷灰石((Ca5(P04)30H)2)的树脂或介质；多峰弱阳离子交换树脂或介质；基于N-苄基-η-甲基乙醇胺的树脂或介质；或基于辛胺的树脂或介质。
[0062]在本发明的方法中，使用溶液，例如结合溶液、洗涤溶液和洗脱溶液。为了方便，所述术语是指在层析的情况下的所述溶液的目的。
[0063]这样的溶液可选地包含例如聚乙二醇(PEG)之类的成分。这样的溶液可选地还包括例如盐之类的成分。此外，这样的溶液可选地包含例如缓冲剂(含tris或磷酸盐缓冲剂的)之类的成分。此外，这样的溶液可包含例如螯合剂(如Η)ΤΑ)之类的成分。
[0064]在具体的实施方式中，在结合溶液中PEG的量为约0%至10%重量/体积、或约0 %至5 %重量/体积、或约0 %至2 %重量/体积。在具体的实施方式中，在洗涤溶液中PEG的量为约1%至10%重量/体积、或约1%至5%重量/体积、或约1%至2%重量/体积。在具体的实施方式中，在洗脱溶液中PEG的量为约0%至20%重量/体积。
[0065]在具体的实施方式中，在结合溶液、洗涤溶液或洗脱溶液中的PEG具有约2，OOOkDa至约40，OOOkDa的分子量。在其它具体的实施方式中，在结合溶液、洗涤溶液或洗脱溶液中的PEG具有约2，OOOkDa至约10，OOOkDa的分子量。
[0066]在具体的实施方式中，盐包括氯化钠(NaCl)、氯化钾(KC1)或氯化钙，或由氯化钠(NaCl)、氯化钾(KC1)或氯化钙组成。在【具体实施方式】中，在结合溶液、洗涤溶液或洗脱溶液中盐的量为约20mM至约1M。在更具体的实施方式中，在结合溶液中盐的量为约20mM至约200mM(例如约100禮)。在更具体的实施方式中，在洗涤溶液中盐的量为约20mM至约200mM(例如lOOmM)。在更具体的实施方式中，在洗脱溶液中盐的量为约200mM至约1M(例如 200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM 或 500mM)，或约 500-1，OOOrnM,或 600_800mM。
[0067]在本发明的方法中，可使用过滤器。过滤器可具有各种孔径。孔径可由数值方便地表示。示例的孔径为从约.20-0.5um(微米)。另外的示例的孔径为从约.20um(微米)至约.22um(微米)，或更具体地约.22um(微米)。另外示例的孔径为从约.22um(微米)至约.30um (微米)、或约.30um (微米)至约.45um (微米)的孔径，或者更具体地约.45um (微米)。
[0068]本发明的方法在减小、降低或消除在纯化的rLV病毒体原料(stocks of rLVvir1ns)内包含的与rLV载体相关的杂质(例如与rLV相关的核酸杂质)的同时，提供了在大规模生产期间rLV滴度的提高，以及具有在其中包含的rLV载体颗粒或病毒体的最小损失。杂质可包括蛋白质、核酸(DNA、RNA)、碎片以及可存在的与rLV载体颗粒或病毒体不同的其它物质。本发明的方法用于在减小、降低或消除杂质的同时提高rLV载体颗粒/病毒体的量。
[0069]在具体的实施方式中，本发明的方法导致以大约5X 105个感染单位(IU)/ml或更大产生病毒载体。在具体的实施方式中，本发明的方法导致以大约6X106个感染单位(IU)/ml或更大产生病毒载体。在具体的实施方式中，本发明的方法导致以约3X 10s个感染单位(IU)/ml或更大产生病毒载体。
[0070]如文中使用，当术语“约”或“大致”以质量或单位测量使用时，是指所表示的数值的可接受的的统计偏差范围。通常，所述范围为所表示的数值的约+/_10%、或+/_5%。
[0071]如文中公开，重组(病毒)载体可包含核酸，例如转基因。“核酸”序列是指DNA或RNA序列。该术语包括包含任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列，所述DNA和RNA碱基类似物为例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙定基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基氨甲基脲嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基鸟嘌呤、5-甲氧基氨基甲基_2_硫脲啼啶、β -D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’ -甲氧羧甲基脲嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、脲嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、脲啼啶-5-氧基乙酸、oxybutoxosine、假尿啼啶、Q核苷、2-巯基胞啼啶、5-甲基_2_巯基尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-巯基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶，Q核苷(que0Sine)，2-巯基胞嘧啶和2，6_ 二氨基嘌呤。
[0072]“编码序列”或“编码”选择的多肽的序列是指当放在合适的调节序列的控制下，在体内转录(在DNA的情形下)和翻译(在mRNA的情形下)成多肽的核酸分子。通过在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。转录终止序列可位于编码序列的3’。
[0073]术语DNA “控制序列”总的来说是指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制的起始、内在性核糖体插入位点(“IRES”)、增强子等，其共同地提供在受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。不是所有的这些控制序列需要一直存在，只要选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中被复制、转录和翻译即可。
[0074]文中使用的术语“启动子”在其普通意义上是指核苷酸区域，包括DNA调控序列，其中调控序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’_方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可包括“可诱导启动子”(多肽序列的表达可操作地连接到被分析物、辅因子、调节蛋白等诱导的启动子)、“可抑制启动子”(多肽序列的表达可操作地连接到被分析物、辅因子、调节蛋白等诱导的启动子)以及“组成型启动子”。
[0075]“可操作地连接”是指其中描述的组件被配置以执行它们通常的功能的元件的布置。因此，可操作地连接到编码序列的控制序列能够影响编码的序列的表达。控制序列不必与编码序列连续，只要它们能指导它们的表达。因此，例如，插入的未翻译但是转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，并且仍可认为启动子序列“可操作地连接”到编码序列。
[0076]该申请中为了描述核苷酸序列在特定核酸分子中的相对位置，例如当描述特定的核苷酸序列相对于另一个序列位于“上游”、“下游”、“3’ ”或“5’ ”，应理解为其是序列在DNA分子的“有义”或“编码”链中的位置，这被认为在本领域中是常规的。
[0077]术语“异源的”与例如编码序列和控制序列的核酸序列相关时，表示通常未连接到一起的序列，和/或通常与特定的细胞不相关。因此，核酸构建物或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内的核酸片段，或者连接到另一个核酸分子的片段，未发现其与其它分子天然相关。例如，核酸分子构建物的异源区域可包括编码序列，在所述编码序列的两侧是未发现与所述编码序列天然相关的序列。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列自身在自然中未发现的构建物(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。相似地，为了本发明的目的，可认为由通常在细胞中不存在的构建物转化的细胞是异源的。如文中使用，等位基因变异或天然产生的突变事件未产生异源的DNA。
[0078]在一实施方式中的“治疗分子”是可缓和或减轻由细胞或受试者中蛋白质缺少或缺陷产生的症状的肽或蛋白质。或者，转基因编码的“治疗的”肽或蛋白质是给予受试者好处的一种物质，例如矫正遗传缺陷，矫正基因(表达或功能)缺陷，或抗癌效果。因此，包含异源核酸的转基因可编码多个有用的产物。这些可包括例如siRNA、反义分子和miRNA。
[0079]转基因可编码激素和生长因子和分化因子，不限制地包括胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(ΕΡ0)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α (TGF-α )、血小板衍生生长因子(TOGF)、胰岛素样生长因子I和II (IGF-1和IGF-1I)，转化生长因子β超家族的任一个，包括TGFi3、激动素、抑制剂，或骨形态形成性蛋白质(ΒΜΡ)ΒΜΡ1_15的任一个，生长因子的heregluin/neuregulin/ARIA/神经鞘分化因子(NDF)家族的任一个、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)、neurturin、聚集蛋白、semaphorins/脑衰蛋白家族的任一个、纺锤蛋白_1和纺锤蛋白_2、肝细胞生长因子(HGF)、红藻氨酸(ephrins)、头蛋白、sonic hedgehog和酪氨酸轻化酶。
[0080]其它有用的转基因产物包括调节免疫系统的蛋白质，不限制地包括细胞因子和淋巴因子，例如促血小板生成素(ΤΡ0)、白细胞介素(IL)IL-l至IL-17、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子，flk_2/fFlt3配体。该免疫系统产生的基因产物还可用在本发明中。这些不限制地包括免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体(例如Kalos et al 2011 ；Porteret al 2011)，例如CCR5之类的G蛋白偶联受体(GPCR)，类别I和类别II MHC分子，以及工程化的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括调节蛋白，例如补体调节蛋白、膜辅蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CRUCF2和CD59。
[0081]其它有用的基因产物包括可矫正先天性代谢缺陷的那些基因产物。这样的转基因可编码例如氨甲酰合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶，延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α -1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，凝血因子，例如因子V、因子Vila、因子VII1、因子IX、因子X、因子XIII或蛋白C，胱硫醚-β -合成酶、支链酮酸脱羧酶、