一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种基于单域抗体的双特异性嵌 合抗原受体及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗 法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及 胞内信号转导区组成。CAR-T细胞疗法通过外源基因转染技术，把识别肿瘤相关抗原的单 链抗体（Single chain fragment variable，scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T 细胞表面，使可以特异识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号 域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特 异性杀伤肿瘤反应。
[0003] ⑶19、⑶20分子是治疗B淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是CAR研究中的热点。靶 向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞（CD19 CAR-T)在治疗多发性、难治性的急 性B淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性B淋巴细胞白血病和B淋巴 细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。CD20分子也是B淋巴细胞系淋巴瘤，尤其是慢性、套 细胞淋巴瘤表面的靶标分子。一般在⑶19阳性的B细胞表面都会表达⑶20。所以理论上 如果能实现针对CD19和CD20的双靶标的双特异性CAR-T技术，其对B淋巴细胞白血病和 B淋巴细胞系淋巴瘤的疗效应该可以明显改善。
[0004] 另外，目前针对⑶19的CAR-T细胞疗法在治疗急性B淋巴细胞白血病的临床试验 中虽然可以在短期内实现90 %左右的完全缓解疗效，但在治疗后数月后发现有约10 %的 患者发生远期复发，主要原因是残存肿瘤细胞产生了 CD19缺失的变异株。因而同时设计针 对肿瘤表面CD19及CD20抗原进行协同CAR-T疗法，将不仅有效提高T细胞加强杀伤信号 并且可以利用像抗生素联用一样的原理，有效地避免发生靶点逃逸现象引起的远期白血病 复发。
[0005] CAR-T细胞的有效激活均严重依赖识别肿瘤相关抗原的抗体的特异性以及抗原 结合的亲和力高低等性质。所以在目前CAR-T细胞胞内信号转导区的设计已经趋于成熟 的现状下，抗原结合区的设计成为新型CAR-T技术开发的重点和关键。从骆驼源重链抗 体（Heavy chain antibody, HCAb)中克隆出仅由一个重链可变区组成的单链抗体，其大小 仅为2. 4X4nm，是能够结合抗原的最小片段，称为单域抗体（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)或纳米抗体。与传统抗体相比，VHH单域抗体分子 量小且表达量高，化学稳定性好，亲和力高并且与人源抗体同源性高，免疫原性低。分子量 小易于进行基因工程改造，构建双重或多重特异性的单域抗体组合，达到一个分子多靶点 或多种功能的效果。VHH组织渗透性好，在进行肿瘤治疗时，具有接触到不能被常规抗体接 触的较为隐蔽的靶点的可能性。正由于这些优点，利用单域抗体作为CAR的抗原结合区进 行CAR修饰及CAR-T细胞疗法是CAR疗法的创新性的发展。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种应用于高效拮抗包括血液病 在内的各种癌症的多靶点的CAR-T细胞疗法中的双特异性单域抗体嵌合抗原受体。
[0007] 本发明的另一目的是提供含有该双特异性单域抗体嵌合抗原受体的T淋巴细胞 或其他免疫效应细胞。
[0008] 本发明的又一目的是提供该双特异性单域抗体嵌合抗原受体的应用。
[0009] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原 受体，胞外信号肽，由两个不同单域抗体构成的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内信号传 导结构域共同组成。
[0010] 所述基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体，其抗原与恶性肿瘤相关联，可以 选自 CD19、CD20、CD22、CD33/IL3Ra、CD38、BCMA、CS1、CD138、c-Met、EGFRvIII、⑶-2、 NY-ES0-1、MAGE A3、糖脂F77中任意二者的组合；优选⑶19与⑶20的组合；进一步优选 的包括CD19及CD20抗原特异性的两个单域抗体VHH链组成的抗原结合结构域，并由一个 Linker 连接。
[0011] 其中，所述的CD19抗原特异性的单域抗体VHH链包括框架区FR和互补决定区 CDR，所述框架区FR包括FRl~FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO:4所示的FRl，SEQ ID NO: 5 所示的FR2, SEQ ID NO:6所示的FR3, SEQ ID NO: 7所示的FR4 ;所述互补决定区CDR包括 CDRl ~CDR3 的氨基酸序列：SEQ ID NO:8 所示的 CDRl，SEQ ID NO:9 所示的 CDR2, SEQ ID 勵：10所示的〇?3。
[0012] 所述的⑶19抗原特异性的单域抗体VHH链优选具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸 序列。
[0013] 编码所述的⑶19抗原特异性的单域抗体VHH链的核苷酸序列优选如SEQ ID NO: 11所示。
[0014] 所述的⑶20抗原特异性的单域抗体VHH链包括框架区FR和互补决定区⑶R，所 述框架区FR包括FRl~FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13所示的FR1，SEQ ID NO: 14所 示的FR2, SEQ ID NO: 15所示的FR3, SEQ ID NO: 16所示的FR4 ;所述互补决定区CDR包括 CDRl ~CDR3 的氨基酸序列：SEQ ID NO: 17 所示的 CDR1，SEQ ID NO: 18 所示的 CDR2, SEQ 10勵：19所示的〇?3。
[0015] 所述的⑶20抗原特异性的单域抗体VHH链优选具有SEQ ID NO: 12所示的氨基酸 序列。
[0016] 编码所述的⑶20抗原特异性的单域抗体VHH链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所 不。
[0017] 所述基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体优选进一步包括共刺激信号传导区， 包括选自下列的共刺激分子的细胞内结构域：⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、⑶40、⑶3、淋 巴细胞功能相关抗原-I (LFA-I)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3与⑶83特异性结合的配体 和其任意组合。
[0018] 所述基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体优选地由⑶8信号肽、⑶19及⑶20抗 原特异性的两个单域抗体、CD28跨膜区以及CD28、CD3胞内信号传导结构域依次串联组成。
[0019] 所述基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体更进一步优选具有SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0020] -种基因工程改造的免疫效应细胞，包括编码本发明所述的双特异性嵌合抗原受 体的核苷酸序列。所述的免疫效应细胞选自T淋巴细胞、NK细胞，造血干细胞、多能干细胞 或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞，优选T淋巴细胞。
[0021] 其中，所述嵌合抗原受体优选由CD8信号肽、CD19及CD20抗原特异性的两个单域 抗体、⑶28跨膜区以及⑶28、⑶3胞内信号传导结构域依次串联组成。
[0022] 所述嵌合抗原受体进一步优选具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，其编码基因 序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023] 本发明所述的双特异性嵌合抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用；优选在制备抗 血液恶性肿瘤的药物中的应用。
[0024] 本发明所述的免疫效应细胞在制备抗肿瘤药物中的应用；优选在制备抗血液恶性 肿瘤的药物中的应用。
[0025] 有益效果：
[0026] 我们利用基因工程手段设计双特异性单域抗体作为CAR的抗原结合区进行CAR修 饰及CAR-T细胞疗法是CAR疗法的创新性的发展。例如，将两个单域抗体结合起来（两个 重链串联）蛋白质结构上和一个重链与轻链串联的scFv其实非常相似，我们的研究也证实 双特异性单域抗体完全可以作为CAR