技术的抗原结合域使用，从而成功地实现了双靶点双 特异性的CAR技术，也在疗效试验中验证了前述双特异性CAR技术相对于传统CAR-T技术 的多种理论优势。同时我们发现此发明还得以避免了以scFv为基础设计的CAR-T所常有 的表达困难、稳定性差等缺陷。我们的CD19x CD20双特异性单域抗体-CAR技术在体外高 效地转导了健康人T淋巴细胞，对于CD19和CD20阳性的靶细胞产生了强力的杀伤效果，在 基于NOG小鼠的高质量人淋巴瘤模式动物体内起到了比单特异性CAR-T更好的治疗效果。
[0027] 本发明通过优化设计⑶19、⑶20特异的单域抗体，提供了 一种⑶19、⑶20双靶 点修饰的CAR-T细胞，能够特异地与⑶19及CD20抗原结合。此外，在B淋巴细胞系恶性 肿瘤治疗中，采用CD19、CD20双靶点修饰的CAR-T细胞进行CAR-T疗法与单独的CD19或 CD20CAR-T相比，明显增强了免疫细胞靶向识别肿瘤抗原的能力，加强了对肿瘤细胞的杀伤 活性。
【附图说明】
[0028] 图1为基于⑶19x⑶20单域抗体的嵌合抗原受体结构图。
[0029] 图2为基于⑶19x⑶20单域抗体双特异性CAR-T体外杀伤效果图。其中，Raji细胞 为靶细胞，A)只加入未转导的T细胞，B)加入⑶19 CAR-T细胞，C)加入⑶19 CAR-T细胞， D)加入CD19xCD20 CAR-T细胞。根据Raji细胞占总细胞的比例结果显示，与未加入CAR-T 细胞的对照组相比，B)、C)与D)组对Raji肿瘤细胞均有杀伤作用，而⑶19x⑶20 CAR-T细 胞的杀伤效果最好。
[0030] 图3为小鼠生存曲线；分别对24只NOG小鼠尾静脉注射Raji细胞。10天以后，将 注射Raji细胞的小鼠随机分成四组，分别注射等量（400万细胞）的T细胞、CD19 CAR-T细 胞、⑶20 CAR-T细胞以及⑶19x⑶20 CAR-T细胞。连续观察动物5周，记录小鼠死亡时间。 注射未转导T细胞的小鼠基本上在20天内全部死亡，注射⑶19 CAR-T细胞的小鼠在40天 时发生1例死亡，注射⑶20 CAR-T细胞的小鼠在42天时发生1例死亡，而注射⑶19x⑶20 CAR-T细胞的小鼠在观察期间均未发生死亡。
【具体实施方式】
[0031] 本发明利用多个各自特异的单域抗体进行CAR设计修饰，涉及识别多个靶点的 CAR-T技术，协同杀伤包括血液系肿瘤的肿瘤，防止免疫逃逸及肿瘤复发。下面结合具体实 施例，进一步阐述本发明。
[0032] 实施例1⑶19与⑶20单域抗体制备
[0033] (一）⑶19与⑶20单域抗体文库构建
[0034] 利用购自R&D SYSTEMS公司的⑶19及⑶20抗原对美洲驼进行定期免疫。第一次 免疫时，分别将200 μ g重组⑶19或⑶20蛋白与等体积弗氏佐剂混合，其后用弗氏不完全 佐剂与抗原混合，进行免疫，每周一次。经多次免疫加强美洲驼对靶抗原的免疫应激反应， 刺激B细胞表达针对靶抗原的重链抗体。
[0035] 免疫期间对免疫动物取血采样，评估免疫反应效果。免疫结束后，取IOOmL美洲驼 外周血淋巴细胞并提取Total RNA，并反转录成cDNA，通过二次PCR扩增美洲驼重链抗体的 可变区片段VHH。将VHH片段构建入噬菌体展示载体中，并通过电转化将携带有单域抗体基 因片段的产物转入感受态大肠杆菌中，从而获得单域抗体免疫文库。
[0036] 第一次 PCR 模板：cDNA ;
[0037] 上游引物 CALL001，如 SEQ ID N0:21 所示：5' -GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3' ；
[0038] 下游引物 CALL002,如 SEQ ID N0:22 所示：5' -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3' ；
[0039] 第二次PCR模板：第一次PCR割胶回收产物；
[0040] 上游引物 BACK-1，如 SEQ ID N0:23 所示：5' -GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGA GG-3' ；BACK-2,如 SEQ ID N0:24 所示：5' -GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGG-3' ；
[0041] 下游引物 PMCF，如 SEQ ID N0:25 所示：5' -CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGG GT-3' ；
[0042] 两次PCR程序均为：预变性94°C、7min，变性94°C、lmin，退火55°C、lmin，延伸 72°C、7min。
[0043] (二）⑶19与⑶20单域抗体筛选及表达
[0044] 利用噬菌体展示技术将单域抗体分子展示于噬菌体表面，进而筛选出抗原特异性 的单域抗体。通过噬菌体酶联免疫吸附ELISA方法，将抗原用IOOmM NaHCO3 (pH 8.0)稀释 至终浓度为100 μ g/mL，包被IOOyL至96孔板中，4°C过夜。经过PBS冲洗、1 %脱脂牛奶 封闭后，加入噬菌体孵育1~2h，然后将抗原特异性的噬菌体洗脱并侵染TGl细胞，在含有 氨苄青霉素的LB培养板上涂布培养，经过多轮筛选逐步达到富集。挑选大量阳性克隆进行 ELISA检测并对阳性克隆进行测序，根据序列比对，确定独特的的克隆并将其序列分为框架 区FR和互补决定区⑶R。
[0045] 将测序正确的克隆接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37°C摇床培养过 夜；接种ImL的菌液至300mL TB培养液中，37°C摇床培养至0D6QQnni= 0. 6~0. 9时，加入 IM IPTG，28°C摇床培养过夜；离心，收菌；利用渗透法，获得抗体粗提液；通过Protein L标 记并利用亲和层析法纯化出单域抗体，其产量均在l〇mg/L以上。利用SPR技术检测抗体的 亲和力，进一步筛选出特异性高的单域抗体。通过以上实施方式，共获得6株CD19单域抗 体、5株CD20单域抗体。选择亲和力较高的单域抗体，其中一株CD19单域抗体具有SEQ ID NO: 11所示的核甘酸序列，一株CD20单域抗体具有SEQ ID N0:20所示的核甘酸序列。
[0046] 实施例2⑶19与⑶20双特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备
[0047] (一）嵌合抗原受体基因片段制备
[0048] 本发明按以下编码基因的顺序设计融合基因片段：CD8信号肽、⑶19 VHH-Iinker-⑶20 VHH、⑶28跨膜区以及⑶28和⑶3 ζ胞内信号结构域，通过基因合成技 术直接合成该融合基因，使表达的嵌合抗原受体具有⑶8 a -VHH(⑶19-linker-⑶20)-⑶28 TM-⑶28-⑶3 ζ的氨基酸结构。将购自Clontech公司的pLVX-Puro载体的CMV启动子改造 为人EFla启动子从而获得pLVX-hEFla载体，将合成的基因片段构建在pLVX-hEFla载体 上，形成重组质粒，命名为 PLVX-CD8 a -VHH(CD19-linker-CD20) -CD28 TM-CD28-CD3 ζ 〇
[0049] CD8信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:26所示；
[0050] Linker的核酸序列如SEQ ID NO:27所示；
[0051] CD28 TM及CD28-CD3 ζ胞内信号结构域的核酸序列如SEQ ID N0:28所示；
[0052] (二）嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建
[0053] 在本发明中，CAR-T细胞通过基因修饰的CAR、慢病毒表达载体构建，转导T细胞而 获得。提取 PLVX-CD8 a -VHH(CD19-linker-CD20)-CD28 TM-CD28-CD3 ζ 表达质粒和 pRRE、 pRSV-rev及pMD2. G辅助质粒，按一定比例混合，共转染293T细胞。转染48h、96h后，收集含 有病毒的细胞培养上清，4°C、3000rpm离心5min。上清经0. 45 μ m滤器过滤后，与PEG8000/ NaCl按4:1体积混匀，4°C静置2~3h后高速离心30min。弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬 溶解，即获得病毒浓缩液，_80°C保存备用。
[0054] (三）T淋巴细胞的制备
[0055] 取50mL健康人新鲜血液，通过淋巴细胞分离液、密度梯度离心方法分离外周血单 核细胞（PBMC)。利用 Pa