脂肪酸酯的生产的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于从糖类生产至少一种脂肪酸酯的生物技术方法和细胞。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸酯在商业上可以用于若干目的。例如，生物柴油（一种替代燃料）包含酯 (例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等）。一些低分子量的酯是挥发性的，具有令人愉快的气味， 这使得它们可用作芳香剂或调味剂。脂肪酸酯也被用作大漆、油漆、清漆等的溶剂。酯也可 以用作树脂和塑料中的软化剂，增塑剂、阻燃剂，以及在汽油和油中的添加剂。此外，酯可以 在聚合物、薄膜、纺织品、染料和药品的制造中使用。因此，脂肪酸酯在当今时代是非常有用 的。
[0003] 可以从石油中提取脂肪酸酯。但是这种方法耗能且昂贵。并且，由于频繁裂化粗 石油中的长链烃以产生更小的单体，这是个低效的方法。然后这些单体被用作原材料以制 造更复杂的特殊化学品。裂化汽油或石油的这种方法是对环境有害的。并且，由于这些起 始材料的成本与石油价格挂钩，以及预期未来石油价格增长，制备这些脂肪酸酯的成本也 相对于石油价格的增长而增长。
[0004] 由于石油造成的固有挑战，因而存在对于不需要像石油那样经勘探、提取、长距离 运输、或充分精炼的可再生的石油来源的需要。还存在对于能够经济地生产，且不会引起像 石油工业和基于石油的燃料燃烧所产生的环境破坏的可再生石油来源的需要。
[0005] 在若干生物燃料中可以发现脂肪酸酯。然而，来自这些生物燃料和/或基于植物 的燃料的脂肪酸酯产率低。因此，需要开发脂肪酸酯的替代生物来源。一个选项是为了有 效生产脂肪酸酯而重组改造微生物物种。
[0006] 已知脂肪酸酯是酰基辅酶A分子和任何链长的醇之间（有时在蜡酯合酶的存在 下）的缩合反应的产物。例如，脂肪酸酯可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁 醇、3-甲基丁醇、或戊醇与酰基辅酶A分子的缩合产物。一些情况下，可以通过向培养基中 供应反应中用到的醇（例如，甲醇或乙醇）来生产脂肪酸酯，如脂肪酸甲基酯（"FAME"）或 脂肪酸乙酯（"FAEE"）。类似地，可以通过供应脂肪醇来生产蜡酯。
[0007] 大多数脂肪酸酯具有上述有用的功能。这些酯之一，月桂酸甲酯 CH3(CH2)1。⑶OCH3(水不溶性、透明的、无色酯）在商品化工业包括制药和化妆品工业上有若 干用途。
[0008] 然而，目前用于制备脂肪酸酯的方法是效率低的，因为它们产生大量的副产物，其 导致资源浪费。并且，当前可用的方法不允许选择特定的脂肪酸酯。因而存在对于更节能 且特定地生产脂肪酸酯包括月桂酸甲酯的需求。
【发明内容】
[0009] 本发明尝试通过提供至少一种从遗传改造的微生物生产脂肪酸酯的方法来解决 上述问题。特别地，所述脂肪酸酯在外源醇，如外源性乙醇、外源性甲醇等存在下，通过培养 被遗传改造以产生脂肪酸和表达至少一种蜡酯合酶的微生物来生产。
[0010] 根据一方面，本发明提供了用于生产至少一种脂肪酸酯的微生物细胞，其中所述 细胞被遗传修饰以包含：
[0011]-至少一个第一遗传突变，其使所述细胞产生至少一种脂肪酸和/或其酰基辅酶 A，其中所述脂肪酸包含至少5个碳原子；和
[0012] -至少一个第二遗传突变，其相对于野生型细胞增加所述细胞中至少一种蜡酯合 酶的活性，且所述蜡酯合酶具有与SEQ ID NO :1-8的多肽及其组合，或与任何用于催化脂肪 酸和/或其酰基辅酶A转化为脂肪酸酯的多肽的功能性片段至少50%的序列同一性。
[0013] 特别地，所述细胞能够通过细胞中相对于野生型细胞的丙二酸单酰辅酶A依赖性 和丙二酸单酰ACP非依赖性脂酰辅酶A代谢途径的增加的酶活性来生产脂肪酸和/或其酰 基辅酶A。
[0014] 根据本发明的任何方面的微生物细胞可以是原核细胞或真核细胞。其可以是哺乳 动物细胞（诸如，例如人的细胞）、植物细胞或微生物如酵母、真菌或细菌，其中，可以使用 微生物，具体是细菌和酵母。
[0015] 合适的细菌、酵母或真菌具体是作为细菌、酵母或真菌菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏库 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))GmbH(DSMZ)，Brunswick， Germany的那些细菌、酵母或真菌根据本发明合适的细菌属于http ://www. dsmz. de/ species/bacteria. htm列出的属，根据本发明合适的酵母属于http ://www. dsmz. de/ species/yeasts. htm列出的那些属，且根据本发明合适的真菌为http ://www. dsmz. de/ species/fungi. htm 列出的那些D
[0016] 具体而言，所述细胞可以选自属：曲霉属（Aspergillus)、棒杆菌属 (Corynebacterium)、短杆菌属（Brevibacterium)、芽抱杆菌属（Bacillus)、不动杆菌 属（Acinetobacter)、产喊杆菌属（Alcaligenes)、乳杆菌属（Lactobacillus)、副球菌 属（Paracoccus)、乳球菌属（Lactococcus)、念珠菌属（Candida)、毕赤酵母属（Pichia)、 汉森酵母属（Hansenula)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、酵母属（Saccharomyces)、埃 希氏菌属（Escherichia)、发酵单胞菌属（Zymomonas)、耶氏酵母属（Yarrowia)、甲基杆 菌属（Methylobacterium)、雷尔氏菌属（Ralstonia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、红螺 菌属（Rhodospirillum)、红细菌属（Rhodobacter)、伯克氏菌属（Burkholderia)、梭菌 属（Clostridium)和贪铜菌属（Cupriavidus) tj更具体而言，所述细胞可以选自构巢曲 霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、广泛产喊菌（Alcaligenes Iatus)、巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、黄 色短杆菌（Brevibacterium flavum)、乳发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum)、 须芒草伯克氏菌（Burkholderia andropogonis)、巴西伯克氏菌（Β· brasilensis)、 Β· caledonica、加勒比伯克氏菌（Β· caribensis)、石竹伯克氏菌（Β· caryophylli)、 B.fungorum、唐菖蒲伯克氏菌（B. gladioli)、格氏伯克氏菌（B.glathei)、荚壳伯克氏菌 (B. glumae)、B. graminis、B. hospita、B. kururiensis、吩嗪伯克氏菌（B. phenazinium)、 B. phymatum、B. phytofirmans、植物伯克氏菌（B. plantarii)、B. sacchari、新加坡伯 克氏菌（Β· singaporensis)、Β· sordidicola、Β· terricola、Β· tropica、Β· tuberum、 B. ubonensis、B. unamae、B. xenovorans、B. anthina、P比略伯克氏菌（B. pyrrocinia)、泰国 伯克氏菌（B.thailandensis)、布兰克念珠菌（Candida blankii)、皱糟念珠菌（Candida rugosa)、谷氨酉爱棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)、Corynebacterium efficiens、 大肠杆菌（Escherichia coli)、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵 母（Kluveromyces Iactis)、扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens)、善变副球 菌（Paracoccus versutus)、阿根廷假单胞菌（Pseudomonas argentinensis)、P.borbori、 香茅醇假单胞菌（P. citronellolis)、变黄假单胞菌（P. flavescens)、门多萨假单胞菌 (P. mendocina)、硝基还原假单胞菌（P. nitroreducens)、食油假单胞菌（P. oleovorans)、 类产碱假单胞菌（Ρ· pseudoalcaligenes)、食树脂假单胞菌（Ρ· resinovorans)、 稻草假单胞菌（P. straminea)、桔黄假单胞菌（P. aurantiaca)、致金色假单胞菌 (P. aureofaciens)、绿针假单胞菌（P. chlororaphis)、莓实假单胞菌（P. fragi)、隆德假 单胞菌（P. Iundensis)、腐臭假单胞菌（P.taetrolens)、P.antarctica、产氮假单胞菌 (P. azotoformans)、Φ. blatchfordae'、P. brassicacearum、P. brenneri、P. cedrina、皱纹 假单胞菌（Ρ· corrugata)、焚光假单胞菌（Ρ· fluorescens)、Ρ· gessardii、Ρ· libanensis、 P. mandelii、边缘假单胞菌（P. marginalis)、地中海假单胞菌（P. mediterranea)、 P. meridiana、P. migulae、霉味假单胞菌（P. mucidolens)、P. orientalis、人参假单 胞菌（P. panacis)、P. proteolytica、罗氏假单胞菌（P. rhodesiae)、类黄假单胞菌 (P. synxantha)、赛维瓦尔假单胞菌（P. thivervalensis)、托拉氏假单胞菌（P. tolaasii)、 韦龙氏假单胞菌（P. veronii)、脱氮假单胞菌（P. denitrificans)、百日咳假单胞菌 (P. pertucinogena)、P. cremoricolorata、黄褐假单胞菌（P. fulva)、蒙氏假单胞菌 (P. monteilii)、摩氏假单胞菌（P. mosselii)、P. parafulva、恶臭假单胞菌（P. putida)、 巴利阿里假单胞菌（P. balearica)、施氏假单胞菌（P. stutzeri)、扁桃假单胞菌 (P. amygdali)、榛色假单胞菌（P. avellanae)、番木瓜假单胞菌（P. caricapapayae)、 菊苣假单胞菌（P. cichorii)、晕斑假单胞菌（P. coronafaciens)、无花果假单胞菌 (P. ficuserectae)、'向日葵假单胞菌（P. helianthi) '、苦楝假单胞菌（P. meliae)、萨氏 假单胞菌（P. savastanoi)、丁香假单胞菌（P. syringae)、番前假单胞菌（P. tomato)、绿黄 假单胞菌（P. viridiflava)、P. abietaniphila、嗜酸假单胞菌（P. acidophila)、伞菌假单 胞菌（P. agarici)、嗜碱假单胞菌（P. alcaliphila)、解碱假单胞菌（P. alkanolytica)、淀 粉皮假单胞菌（P. amylodera