或 者分子的折叠或结构被缺失、取代或通过插入被替换，或者必需氨基酸以保守的方式被替 换以达到参考序列或由其衍生的分子的生物活性被保留的效果。
[0092] 特别地，根据本发明的任何方面的方法在根据本发明的任何方面的细胞中进行。
【附图说明】
[0093] 图1是显示4个FFA生产菌株在68小时后摇瓶培养物中的游离脂肪酸（FFA)生 产的图。
[0094] 图2是显示在50ml摇瓶（0D6。。= 2)中评价的BXF_169的月桂酸生产概况的图。
[0095] 图3是显示在8、24和48小时测定的BXF_169中多种途径基因的相对于cysG的 mRNA表达的图。
[0096] 图4是显示在8小时和24小时在BXF_169的溶胞产物中测量的多个延长步骤的 酶活性的图。EnCR活性由Ter基因编码。KAS活性由NphT7和FabH基因编码。
[0097] 图5是显示来自用FadB、FadB+Crt和FadB+Crt+Hbd重建的体外途径的对月桂酰 辅酶A生产途径的C4 - C6延长步骤特异的中间产物形成和利用的图（C6 - C12中间体的 数据收集到，但没有示出）。
[0098] 图6是显示对20种可溶WES候选物测量的产物形成的图。经纯化的候选酶各自 与甲醇和C6-至C14-辅酶A底物孵育来评估产物形成。
[0099] 图7是显示用2mL小规模方案评价的9个基于硫解酶的表达不同蜡酯合酶候选物 的菌株在24小时时的FAME生产的图。
[0100] 图8是显示用月桂酸甲酯生产的多种版本的合酶途径改造的50个菌株在1ml，24 小时菌株筛选测定中的月桂酸甲酯和其他FAME (C6-C14)的生产的图。
[0101] 图9是显示在多种测试条件下，在IL发酵中40小时后，菌株BXE_022所展示的 FAME产物分布的图。
[0102] 图10是显示菌株BXE_058和BXE_062在生产大约45个小时时的FAME和FFA浓 度分布的图；因为50g/L作为第二阶段被加入，所以肉豆蔻酸甲酯浓度不包括在分析中。
[0103] 图11是涉及通过中间体丙二酸单酰辅酶A增加流量（flux)的遗传修饰的细胞的 代谢途径的图解。
[0104] 图12是显示评价对月桂酰辅酶A生产途径的C4 - C6延长步骤特异的中间产物 积累的图（C6 - C12中间体的数据收集到，但没有示出）。
[0105] 图13是显示与野生型FabH比较三个FabH突变酶与C6-C10辅酶A底物的特异酶 活性的图。
[0106] 图14是显示在标准ImL方法中，20小时的生产后，FAME生产的图。（注：BXE_198 是BXE_271-273的对照比较，和BXE_233是BXE_243-244的对照）。
[0107] 图15是显示在标准ImL方法中，用可替代WES酶候选物的20小时的生产后FAME 生产的图。
[0108] 图16是显示如通过GC-MS测量的用经纯化的Mhyd变体孵育5分钟后，从甲醇和 C12辅酶A的体外产物形成的图。
[0109] 图17是显示在标准ImL方法中，用Maqu突变体（SEQ ID NO :7和8) 20小时的生 产后FAME生产的图。
[0110] 图18是显示如通过GC-MS经随时间的产物形成所测量的BXE_062和BXE_233细 胞裂解物的WES酶活性的图。在细胞裂解物中WES的目标活性为0. 02U/mg。
[0111] 图19是显示在FM14方法中用BXE_276的IL发酵的月桂酸甲酯和总FAME平均生 产概况的图。
【具体实施方式】
[0112] 实施例
[0113] 如本领域技术人员应当理解，前文描述的优选实施方案可以在设计、构建或操作 上进行变化或修改，而不背离权利要求的范围。这些变化例如旨在被权利要求的范围覆盖。
[0114] 实施例1
[0115] 大肠杆菌中C12脂酰辅酶A生产的优化
[0116] 在摇瓶实验中经由丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A生产脂肪酸
[0117]
[0119] 表4a.在随后的实施例中用于生产脂肪酸的微生物菌株的列表。生产的方法和菌 株的序列提供于 W02014026162A1(0PX Biotechnologies Inc.，USA)的表 3. 2 中。
[0120] 基础菌株是通过染色体整合Hbd和Crt进入BX_1018亲本株构建的。转化下组的 菌株并且小规模评价FAME生产和代谢物积累。
[0122] 表4b.用于测试FAME生产中的hbd和crt存在的菌株列表
[0123] 为了更好地理解Hbd/Crt表达的影响，与丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A底物孵 育后，在细胞裂解物中监测代谢物积累。如图12所呈现，该测定的结果显示与预期的对 酮-和羟基-C4辅酶A活性相一致的增加的C4-C6辅酶A中间体的积累。
[0124] β -酮脂酰辅酶A合酶（FabH)的改造
[0125] 基于对C4-至ClO酰基辅酶A底物的证实活性，将筛选方法用于β -酮脂酰辅酶A 合酶类似物，以鉴定月桂酸生产的候选物。多于70种类似物已被合成、表达、纯化，并评价 体外活性。
[0126] 鉴定出的对C4-至ClO辅酶A底物具有显著活性的合酶候选物被掺入到生产宿主 中并在摇瓶中评价FFA生产。图1显示了展示显著的月桂酸生产的若干改造菌株（表4c) 在68小时时的FFA生产概况。如所不，月桂酸和总FFA生产概况受掺入的各自合酶候选物 调节。例如，菌株BXF_198(其含有Aagr fabH构建体）显示对月桂酸最高的特异性，而总 FFA中Rsol fabH的共表达对应于最高滴度。已经选择图1中所示的所有四个合酶组合用 于关注月桂酸甲酯的生产的实施例3。
[0128] 表4c.用于筛选期的具有特定质粒的细菌菌株
[0129] 基线FFA分析
[0130] 用FFA的生产菌株亚组与如上所述的多种合酶组合完成更广泛的基线分析。呈现 了菌株BXF_169的数据；在更广泛的测试中评价的所有菌株中观察到了类似的趋势。在图 2中呈现的数据显示了菌株BXF_169的月桂酸生产的时间过程。在摇瓶测试的条件中，菌株 展示出稳定的初始生产速率持续10-20小时。20小时后，速率显著降低并且产物滴度趋于 平稳。
[0131] 对于所有分析的菌株，在每个时间点取样并分析脂肪酸生产途径中的关键酶的转 录、表达以及活性。图3和4显示途径基因的相对mRNA表达以及BXF_169随时间的相应酶 活性。转录水平是好的，但是尽管从相同的启动子驱动，五个基因间也有所不同。转录和酶 活性随着时间的推移均呈递减趋势，且若干反应在24小时的时间点上酶活性下降。对于所 有其他评价的FFA生产菌株观察到了类似的趋势。
[0132] 除了降低的mRNA和酶活性，24小时时间点的特征还在于所有菌株增加的不溶性 蛋白质积累和减少的葡萄糖消耗（数据未显示）。由于已知脂肪酸包括月桂酸在不存在特 定转运蛋白的情况下在细胞内积累，因此假设在24小时时生产率的降低是由于细胞内FFA 毒性。
[0133] 脂肪酸合成途径的体外分析
[0134] 通过用经纯化的酶在体外重建脂酰辅酶A途径开发测定。体外重建简化了限速步 骤的鉴定，其特征在于反应条件下的代谢物积累。体外途径重建有若干优点，包括从竞争性 酶（例如硫酯酶）分离途径流量、底物限制（例如NADH库），以及多个途径酶的均衡表达。 通过在不同量的酶或底物（酰基辅酶A中间体）的存在下定量从丙二酸单酰辅酶A到月桂 酰辅酶A的所有20个途径中间体来评价该途径的平衡。
[0135] 图5显示了改变酮脂酰辅酶A还原酶（KCR)和3-羟酰辅酶A脱水酶（3HCDh)反 应的酶时，观察到的C4至C6延长循环的途径中间体的积累。如所示，当途径是用FadB重 建时，存在3-羟基丁酰辅酶A的显著积累，提示3HCDh活性不足以驱动反应向前。所观察 到的积累可能是由于偏爱该酶来催化逆反应，其也可降低体内总体向前途径流量。然而，当 FadB被Hbd和/或Crt (可替代的KCR和3HCDh酶，其具有在C4中间体向前方向的显著活 性）补充时，观察到3-羟基丁酰辅酶A积累的降低。这些数据提示所述补充活性足以驱动 途径向前至丁酰辅酶A并且Hbd和Crt整合到生产宿主可以加强长链脂肪酸的生产。
[0136] 合酶突变体评价
[0137] 从被开发用于检测对ClO辅酶A具有提高活性的有益突变的基于96孔板的筛选 中分离FabH变体。在> 1000个突变体的初筛后，阳性变体进行了测序并评价了对C6-C10 辅酶A的活性。如图13所示，证实已鉴定的三个纯化的变体对C6-C10辅酶A底物具有增 加的活性。
[0138] 在阳性证实之后，在体内评价FabH突变体。通过将FabH突变掺入到BXE_198和 BXE_233中来构建下列囷株。
[0139] 在标准ImL筛选方案中评价菌株在20小时内的FAME生产（图14)。如下所示， 与对照菌株（菌株BXE_198和BXE_233)相比，观察到了 E37K(菌株BXE_271)和D196G/ K342E(菌株BXE_273和BXE_243)变体增加的月桂酸甲酯。然而，当具有hbd/crt模块时， 期望这些突变在具有提高的WES活性的生产菌株中具有更大的影响。
[0140] 利用当前的生产菌株已始终证明在溶胞产物中Aagr FabH达到目标活性的所需表 达需要总蛋白库的显著比例。此外，即使具有高水平的表达，对ClO辅酶A的FabH活性往 往是处于或稍低于目标活性。
[0141]
[0142] 表4d通过将FabH突变掺入BXE_198和BXE_233中来构建以下菌株。
[0143] 实施例2
[0144] 对月桂酸甲酯生产优化蜡酯合酶（WES)活性
[0145] 将WES候选物表达、纯化并体外评价溶解度和FAME产生。基于初筛结果，选择21 个WES候选物用于进一步的评价，包括底物特异性和体内FAME产生。体外测定通过加入各 自辅酶A底物后测量产物形成来完成。如图6中总结，在多种底物上观察到一系列活性并 基于对底物彡C12-辅酶A(M360. 2，Acip)的高整体活性（Svar，Maqu)或特异性鉴定了许多 候选物。上述表1中提供了使用的WES序列。
[0146] 作为测试体内活性的正交方法，在甲醇的存在下，在脂肪酸生产宿主中表达9个 显示出对月桂酰辅酶A有活性的WES候选物（表4f)。
[0147]
[0148] 表4f.在甲醇的存在下，在脂肪酸生产宿主中表达9个显示出对月桂酰辅酶A有 活性的WES候选物
[0149] 对于在具有2mL的工作体积的20mL加帽玻璃试管中培养的0D6。。= 2. 0的每个菌 株完成了小规模评价。在24小时时通过取出ImL的培养物取样用于生长和葡萄糖测定，且 在通过GC-MS分析FAME生产之前用MTBE提取剩余培养液。如图7所示，观察到月桂酸甲 酯滴度范围为〇. 04-0. 5g/L，表明了适度的体内WES活性。
[0150] 体内观察到的产物形成的特异性与基于体外测定预测的显著不同。这种差异可能 是由于硫解酶FFA菌株的生产概况，其产生几乎相等滴度的从C6至C16FFA。由于在硫解酶 菌株中筛选蜡酯合酶候选物的局限性，后续的体内表征在基于合酶的菌株中进行，所述菌 株以更高的特异性、速率