铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，具体涉及铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ -聚谷氨酸中的应用。
【背景技术】
[0002]γ -聚谷氨酸(γ -PGA)是由谷氨酸单体通过γ -谷氨酰胺键聚合而成的一类均聚氨基酸。由于谷氨酸分子具有两个羧基，因此其均聚物有两种异构体。而至今发现的生物合成的聚谷氨酸均为γ-PGA，S卩谷氨酸单体之间通过γ-羧基和α-氨基形成的酰胺键连接而成。γ-PGA主要由芽孢杆菌属分泌出的胞外多肽，是这些微生物的荚膜的主要成分。它能保护微生物并且降低受外界环境的影响。γ -PGA是一种线性的高分子，且具有许多羧基，在链内链间形成大量的氢键，使γ -PGA具有很高与水相溶性。γ -PGA是由谷氨酸通过肽键连接起来，易受环境中微生物和酶的作用，降解成无毒的短链多肽或谷氨酸单体。因此γ -PGA具有很好的生物相容性和生物可降解性，是一种绿色生物产品。γ -PGA在食品、医药、环境、农业、日化等行业都具有广阔的应用前景。如在食品行业可用作防冻剂和钙离子稳定剂；医药方面可用作药物载体和黏合剂；环境方面可作为絮凝剂和金属吸附剂；农业方面可用作农林保水剂、肥料缓释剂和肥料增效剂；日化方面可以制备为纸尿裤的吸水凝胶和作为化妆品的保水成分。
[0003]γ -PGA作为一种高聚物，分子量是其重要的结构参数之一。不同用途需要对所需求的γ-PGA的分子量都有所不同。而直接发酵所得的γ-PGA的分子量分布大于1000kD。在化妆品领域，医学领域所需γ-PGA主要都是分子量小于500kD。因此生产低分子量γ-PGA很必要。目前主要利用酸/碱水解大分子量的γ-PGA，虽然在工业生产中最常用，但有数据表明酸水解后γ-PGA含量会明显减少。如能通过调整和优化发酵培养基，在微生物发酵阶段直接降低产物分子量，开发一种高效低成本生产低分子量γ-PGA的新工艺，将具有较好的前景。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ_聚谷氨酸中的应用。
[0005]本发明的铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸中的应用，其特征在于，铁离子能够提高低分子量γ -聚谷氨酸的产量，所述的铁离子为二价铁离子或三价铁离子。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种利用铁离子提高低分子量γ -聚谷氨酸产量的液体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007]将铁离子加入到发酵培养基中并混合，由此得到含有铁离子的发酵培养基，然后将枯草芽孢杆菌接种到含有铁离子的发酵培养基中发酵培养生产低分子量γ-聚谷氨酸；
[0008]或者，将枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中培养，当发酵液中γ -聚谷氨酸含量达I8g/L以上时，加入铁离子至发酵液中，混合后继续发酵生产低分子量γ -聚谷氨酸；
[0009]所述的铁离子为二价铁离子或三价铁离子。
[0010]优选，当铁离子为二价铁离子时，其在含有铁离子的发酵培养基或发酵液中的浓度为 2.81 ?14.lmmol/Lo
[0011]优选，当铁离子为三价铁离子时，其在含有铁离子的发酵培养基或发酵液中的浓度为 2.96 ?29.6mmol/L0
[0012]优选，所述的发酵培养基每升含有:柠檬酸12g、甘油80g、L-谷氨酸20g、氯化铵7g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、二水氯化妈0.15g和一水硫酸猛0.104g，余量为水，pH 6.5o
[0013]优选，所述的铁离子是以氯化铁、硫酸亚铁或柠檬酸铁的形式加入。
[0014]优选，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏编号为:CCTCC NO:M206102o
[0015]所述的将枯草芽孢杆菌接种到含有铁离子的发酵培养基中发酵培养或者将枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中培养，优选，其种子液的接种量为1?10%，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养72?120h，摇床转速80?150r/min，冲程为65?75mm。
[0016]本发明提供了铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ -聚谷氨酸中的应用，将铁离子应用于枯草芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸发酵生产，可以大大提高低分子量γ-聚谷氨酸的产率，并且保持γ -聚谷氨酸的高产；利用本发明方法，使高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ_聚谷氨酸的百分数从原来的66.16%下降到27.38%?4.01%，而低于100kD的γ -聚谷氨酸(低分子量γ -聚谷氨酸)的含量占总γ -聚谷氨酸的百分数从原来的4.59%上升至33.13%?81.03% ;同时γ -聚谷氨酸的产量维持20g/L以上。本发明的铁离子提高低分子量γ_聚谷氨酸的产量的发酵方法简单有效，是一种廉价高效生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018]以下实施例中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) PGA-7，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为:CCTCC NO:M206102，该菌公开于专利号:ZL 200610122640.5，发明名称为:γ -聚谷氨酸产生菌及利用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法的专利中。
[0019]实施例1:
[0020]菌种的活化:将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌种接种在固体培养基斜面上，37°C培养16?24h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌种。所述的固体培养基的成分:蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，余量为水，pH7.0?7.2 ;配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。
[0021]种子液的制备:取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50mL发酵培养基的300mL三角瓶中，37°C，lOOrprn振荡培养18h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的发酵培养基的成分:柠檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化铵7g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，二水氯化钙0.15g/L，一水硫酸锰0.104g/L，余量为水，调pH为6.5 ;配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。
[0022]液体摇瓶发酵:按上述方法配制发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数2.5%接入到发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养72h，摇床转速80r/min，冲程为75mm ;当发酵液中γ -聚谷氨酸达到18.2g/L时，加入无菌的三氯化铁溶液，使发酵液中的三价铁离子浓度达到14.8mmol/L,继续培养48h0所述的无菌的三氯化铁溶液是先配制0.2mol/L三氯化铁溶液，然后经0.22 μ m滤膜过滤灭菌而得(下同)。发酵完毕，检测γ_聚谷氨酸的产量为21.01g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为4.45%，245-100kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为26.73%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ_聚谷氨酸为68.82%ο
[0023]实施例2:
[0024]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0025]液体摇瓶发酵:在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入三氯化铁，使三价铁离子的终浓度为2.96mmol/L,配制成含有铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数1 %的量接种至含有铁尚子的发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养72h，摇床转速80r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ -聚谷氨酸的产量为25.76g/L。分子量分布为高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为27.38%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为39.49%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为33.13%。
[0026]实施例3:
[0027]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0028]液体摇瓶发酵:在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入三氯化铁，使三价铁离子的终浓度为7.4mmol/L,配制成含有铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5%的量接种至含有铁离子的发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75_。发酵完毕，检测y -聚谷氨酸的产量为24.69g/Lo分子量分布为高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为9.29%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为32.35%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为58.36%。
[0029]实施例4:
[0030]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0031]液体摇瓶发酵:在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入三氯化铁，使三价铁离子的终浓度为11.lmmol/L，配制成含有铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5%的量接种至含有铁尚子的发酵培养基中，发酵温度37 °C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ -聚谷氨酸的产量为22.70g/L。分子量分布为高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为5.37%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为27.02%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为67.61 %。
[0032]实施例5:
[0033]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0034]液体摇瓶发酵:在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入三氯化铁，使三价铁离子的终浓度为14.8mmol/L,配制成含有铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5%的量接种至含有铁尚子的发酵培养基中，发酵温度37 °C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ -聚谷氨酸的产量为22.58g/L。