分子量分布为高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为8.ll%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为28.80%，低于lOOkD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为63.09%。
[0035]实施例6:
[0036]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0037]液体摇瓶发酵:在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入三氯化铁，使三价铁离子的终浓度为29.6mmol/L,配制成含有铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数5%的量接种至含有铁尚子的发酵培养基中，发酵温度37 °C，在往复式摇床振荡培养120h，摇床转速150r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ _聚谷氨酸的产量为24.19g/L。分子量分布为高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为4.84%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为14.13%，低于lOOkD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为81.03%。
[0038]实施例7:
[0039]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0040]液体摇瓶发酵:在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入柠檬酸铁，使三价铁离子的终浓度为16.3mmol/L,配制成含有铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数10%的量接种至含有铁尚子的发酵培养基中，发酵温度37 °C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为65mm。发酵完毕，检测γ _聚谷氨酸的产量为24.19g/L。分子量分布为高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为15.41%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为33.89%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为50.70%。
[0041]实施例8:
[0042]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0043]液体摇瓶发酵:配制0.2mol/L硫酸亚铁溶液，经0.22 μ m滤膜过滤灭菌，得到无菌的硫酸亚铁溶液。在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入硫酸亚铁溶液，使二价铁离子的终浓度为2.81mmol/L，配制成含有亚铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数2.5%的量接种至含有亚铁离子的发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ _聚谷氨酸的产量为26.80g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为13.09%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为35.45%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为51.46%。
[0044]实施例9:
[0045]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0046]液体摇瓶发酵:配制0.2mol/L硫酸亚铁溶液，经0.22 μ m滤膜过滤灭菌，得到无菌的硫酸亚铁溶液。在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入硫酸亚铁溶液，使二价铁离子的终浓度为7.02mmol/L，配制成含有亚铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数2.5%的量接种至含有亚铁离子的发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ _聚谷氨酸的产量为27.05g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为10.24%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为32.37%，低于lOOkD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为57.39%。
[0047]实施例10:
[0048]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0049]液体摇瓶发酵:配制0.2mol/L硫酸亚铁溶液，经0.22 μ m滤膜过滤灭菌，得到无菌的硫酸亚铁溶液。在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入硫酸亚铁溶液，使二价铁离子的终浓度为10.53mmol/L，配制成含有亚铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数2.5%的量接种至含有亚铁离子的发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ _聚谷氨酸的产量为25.18g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为4.75%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为25.11%，低于lOOkD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为
70.14%。
[0050]实施例11:
[0051]菌种的活化和种子液的制备步骤与实施例1相同。
[0052]液体摇瓶发酵:配制0.2mol/L硫酸亚铁溶液，经0.22 μ m滤膜过滤灭菌，得到无菌的硫酸亚铁溶液。在发酵培养基(配方同实施例1的发酵培养基)中加入硫酸亚铁溶液，使二价铁离子的终浓度为14.lmmol/L，配制成含有亚铁离子的发酵培养基，分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按接种量为体积分数2.5%的量接种至含有亚铁离子的发酵培养基中，发酵温度37°C，在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ _聚谷氨酸的产量为25.56g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为4.01%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为24.16%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为
71.83%。
[0053]对比例1:
[0054]菌种的活化:将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌种接种在固体培养基斜面上，37°C培养16?24h，得到活化的枯草芽孢杆菌菌种。所述的固体培养基的成分:蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，余量为水，pH7.0?7.2 ;配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。
[0055]种子液的制备:取2环上述活化的枯草芽孢杆菌菌种，接入装有50mL发酵培养基的300mL三角瓶中，37°C，lOOrprn振荡培养18h，得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的发酵培养基的成分:柠檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化铵7g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，二水氯化钙0.15g/L，一水硫酸锰0.104g/L，余量为水，调pH为6.5 ;配制方法是将上述成分混合均匀后，调pH值，然后灭菌备用。
[0056]液体摇瓶发酵:按上述按配方配制发酵培养基分装50mL入300mL三角瓶，将枯草芽孢杆菌种子液按照接种量为体积分数2.5%接种到发酵培养基中，发酵温度37°C。在往复式摇床振荡培养96h，摇床转速110r/min，冲程为75mm。发酵完毕，检测γ -聚谷氨酸的产量为22.95g/L。分子量分布为高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ_聚谷氨酸为66.16%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ -聚谷氨酸为29.25%，低于lOOkD的的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸为4.59%。
【主权项】
1.铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸中的应用，其特征在于，铁离子能够提高低分子量γ -聚谷氨酸的产量，所述的铁离子为二价铁离子或三价铁离子。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) PGA-7，其保藏编号为:CCTCC NO:M206102o3.一种利用铁离子提高低分子量γ -聚谷氨酸产量的液体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤: 将铁离子加入到发酵培养基中并混合，由此得到含有铁离子的发酵培养基，然后将枯草芽孢杆菌接种到含有铁离子的发酵培养基中发酵培养； 或者，将枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中培养，当发酵液中γ-聚谷氨酸含量达18g/L以上时，加入铁离子至发酵液中，混合后继续发酵培养； 所述的铁离子为二价铁离子或三价铁离子。4.根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，当铁离子为二价铁离子时，其在含有铁离子的发酵培养基或发酵液中的浓度为2.81?14.lmmol/Lo5.根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，当铁离子为三价铁离子时，其在含有铁离子的发酵培养基或发酵液中的浓度为2.96?29.6mmol/Lo6.根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基每升含有:柠檬酸12g、甘油80g、L-谷氨酸20g、氯化铵7g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、二水氯化钙0.15g和一水硫酸锰0.104g，余量为水，pH 6.5。7.根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述的铁离子是以氯化铁、硫酸亚铁或柠檬酸铁的形式加入。8.根据权利要求3所述的液体发酵方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) PGA-7，其保藏编号为:CCTCC NO:M206102。
【专利摘要】本发明公开了铁离子在枯草芽孢杆菌发酵生产低分子量γ-聚谷氨酸中的应用。将铁离子应用于枯草芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸发酵生产，可以大大提高低分子量γ-聚谷氨酸的产率，并且保持γ-聚谷氨酸的高产；利用本发明方法，使高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的66.16％下降到27.38％～4.01％，而低于100kD的γ-聚谷氨酸的含量占总γ-聚谷氨酸的百分数从原来的4.59％上升至33.13％～81.03％；同时γ-聚谷氨酸的产量维持20g/L以上。本发明的铁离子提高低分子量γ-聚谷氨酸的产量的发酵方法简单有效，是一种廉价高效生产低分子量γ-聚谷氨酸的方法，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12P13/02, C12R1/125
【公开号】CN105385717
【申请号】CN201510767575
【发明人】冯劲, 施庆珊, 疏秀林, 冯静, 阳运华, 黄小茉
【申请人】广东省微生物研究所
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月11日