与直肠腺癌相关的基因标记物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及MNBA基因在直肠腺癌诊断、治疗中的用 途。
【背景技术】
[0002] 直肠腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国，直肠腺癌死亡率居恶性肿瘤第 五位，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重危害人类健康。尽管诊疗技术不断发展，患 者术后5年生存率并无明显改善，缺乏有效的诊断方法实现对直肠腺癌及癌前病变的早期 诊治是主要的原因之一。直肠腺癌是一种典型的上皮性恶性肿瘤，腺癌是直肠腺癌最主要 的组织学类型。直肠腺瘤也成为上皮内瘤变，根据组织结构和细胞学上的异型性可分为低 级别上皮内瘤变（I级腺瘤和II级腺瘤）和高级别上皮内瘤变（III级腺瘤和原位癌）。直 肠腺瘤发病率与年龄相关，40岁以下人群发病率约20 %~30 %，而40岁以上人群发病率上 升至40%~50%。目前，腺瘤被公认为直肠腺癌最重要的癌前病变，早期发现并切除腺瘤 病变是降低直肠腺癌发病率及死亡率的有效手段。
[0003] 直肠腺癌早期临床症状隐匿，不易发现，大多患者就诊时已到中晚期，失去了最 佳手术时机。有报道表明，早期直肠腺癌患者术后5年生存率约为90%，而晚期患者仅为 15%。因此，早发现、早治疗是降低直肠腺癌患者高死亡率、改善预后的关键。目前临床上 直肠腺癌早期诊断主要依赖于肠镜、影像学检查和血清学标志物癌胚抗原（CEA)等，肠镜 是直肠腺癌诊断最可靠的方法，但具有侵入性、费用昂贵，患者依从性差；CT和超声检查不 易发现较小病变，对直肠腺癌的早期诊断受到一定限制；CEA是临床广泛应用的血清标志 物，其敏感性和特异性较低，主要用于直肠腺癌患者的治疗监测。随着分子生物学技术的发 展，国内外研究者不断探索直肠腺癌新的生物标志物，以对传统肿瘤标志物进行有效补充， 从而对直肠癌早期诊断、早期治疗和预后提供可能的分子生物学理论指导。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与直肠腺癌转移相关的分 子标志物。该基因标志物能及时、特异、灵敏的预判直肠腺癌转移的风险、诊断直肠腺癌是 否发生转移，改善直肠腺癌患者的预后。
[0005] 本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了 MNBA基因及其表达产物在制备预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠 腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品中的应用。
[0007] 进一步，上面所提到的产品能够通过检测直肠腺癌组织中MANBA基因的表达水平 来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发。
[0008] 进一步，所述通过检测直肠腺癌组织中MANBA基因的表达水平：通过RT-PCR、实时 定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MNBA基因及其表达产物的表达水平进行检测。
[0009] 其中，所述用RT-PCR来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判 断直肠腺癌转移是否复发的产品至少包括一对特异扩增MNBA基因的引物；所述用实时定 量PCR预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发 的产品至少包括一对特异扩增MNBA基因的引物；所述用免疫检测预判直肠腺癌转移风 险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品包括：与MNBA蛋白特 异性结合的抗体；所述用原位杂交预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判 断直肠腺癌转移是否复发的产品包括：与MNBA基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片 预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品 包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MANBA蛋白特异性结合的抗体，基因芯 片包括与MNBA基因的核酸序列杂交的探针。
[0010] 优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
[0011] 本发明提供了一种预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直 肠腺癌转移是否复发的产品，所述产品能够通过检测直肠腺癌组织中MNBA基因的表达水 平来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移。
[0012] 进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片； 所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括 用于检测MNBA基因转录水平的针对MNBA基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固 相载体以及固定在固相载体的MNBA蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒 和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测MNBA基因转录水平的试剂； 所述蛋白免疫检测试剂盒包括MNBA蛋白的特异性抗体。
[0013] 进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方 法检测MNBA基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对MNBA基因的 引物和/或探针。根据SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息设计出可以用于检测MNBA基 因表达水平的引物和探针。
[0014] 与MANBA基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其 它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最 长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探 针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0015] 进一步，所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有 硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
[0016] 进一步，所述MNBA蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MNBA 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与MNBA蛋白的结合能力即可。用于蛋白质 水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗 体。
[0017] 本发明还提供了 MNBA基因及其表达产物在制备抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭 的药物中的应用。
[0018] -方面，本发明所述的"抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭的药物"包含MNBA基因 和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制MANBA基因表达的物质、抑制MNBA基 因表达产物稳定性的物质、和/或抑制MNBA基因表达产物活性的物质。
[0019] 另一方面，本发明所述的"抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭的药物"包括能够括抑 制细胞生长、促进细胞凋亡的物质。
[0020] 进一步，本发明所述的治疗直肠腺癌的药物包括：通过干扰RNA抑制MNBA基因表 达的双链核糖核酸，或基于MNBA抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制MNBA蛋白活性的蛋白 质。
[0021] 优选的，所述抑制剂是针对MNBA基因的siRNA
[0022] 本发明还提供了一种用于治疗直肠腺癌转移、侵袭的药物，所述药物包含MNBA 基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制MANBA基因表达的物质、抑制MNBA 基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制MNBA基因表达产物活性的物质。
[0023] 进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制MNBA基因表达的双链核糖核 酸，或基于MANBA抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制MNBA蛋白活性的蛋白质。
[0024] 本发明的药物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大 提尚治疗的成功率。
[0025] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括（但并不限 于）：稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、 麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚 乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素 等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六 烧醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和阜粘土等； 润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉 末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月 桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇（粒状或粉状）、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、 赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖 粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代 羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。
[0026] 本发明的药物可以使用不同的添加剂进行制备，例如杀菌剂、缓冲剂、稳定剂、等