建议的条件。
[0059] 实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物
[0060] 1、样品的收集
[0061] 各收集8例直肠腺癌非转移组织和直肠腺癌转移组织样本，上述所有标本的取得 均通过组织伦理委员会的同意。
[0062] 2、RNA样品的制备（利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作）
[0063] 1)制冰，取组织放入研钵，将其研为碎末，研磨过程要保持组织冷冻。
[0064] 2)将组织转入I. 5ml EP管中，加入1ml Trizol试剂，用研磨棒细研磨，漩涡混合 器充分匀浆，冰浴lOmin。
[0065] 3) 4°C，12000rpm 离心 lOmin。
[0066] 4)吸取上层水相至另一新I. 5ml EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，反复吹 打，冰浴IOmin。
[0067] 5) 4?，12000rpm 离心 lOmin。
[0068] 6)吸取上清至另一新I. 5ml EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，反复吹打，冰 浴 IOmin0
[0069] 7) 4°C，12000rpm 离心 lOmin，弃上清。
[0070] 8)加入75%乙醇Iml摇振充分混勾，4°C，7500rpm离心10min，弃上清。
[0071] 9)重复步骤8)。
[0072] 10)倒尽上清，自然干燥。DEPC水完全溶解RNA，取1 μ I RNA加入99 μ 1蒸馏水， 蛋白核酸分析仪测0D260及0D280。
[0073] 3、高通量转录组测序
[0074] I) RNA-seq 读段定位
[0075] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat vl. 3. 1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组（hgl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段（默 认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立 可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我 们使用TopHat方法的系统默认参数。
[0076] 2)转录丰度评估
[0077] 匹配上的读段文件通过Cufflinks vl. 0· 3处理，Cufflinks vl. 0· 3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因 Ikb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cuff links使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_sapiens. GRCh37. 63. gtf) ο
[0078] 3)差异表达基因的检测
[0079] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在Cuffidff输出中只有q值< 0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0080] 4、结果
[0081] RNA-seq结果显示，MANBA基因在直肠腺癌转移组织中的表达量显著高于非转移 组织。
[0082] 实施例2 QPCR测序验证MANBA基因的差异表达
[0083] 1、根据高通量测序的检测结果选择MANBA基因进行大样本QPCR验证。按照实施 例1中的样本收集方式选择直肠腺癌非转移组织和直肠腺癌转移组织各70例。
[0084] 2、RNA提取步骤同实施例1。
[0085] 3、逆转录：
[0086] 1)反应体系：
[0088] 2)逆转录反应条件
[0089] 按照RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0中逆转录反应条件进行。
[0090] 42°C ~55°C 60min，99°C 2min，5°C 5min。
[0091] 3)聚合酶链反应
[0092] 1)引物设计
[0093] 根据Genebank中MANBA基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博 迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
[0094] MANBA 基因：
[0095] 正向引物为 5' -TATGAACTCTGTGATGAA-3'（SEQ ID NO. 3);
[0096] 反向引物为 5' -ATATGATGATAGAAGGATGA-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0097] β-actin 基因：
[0098] 正向引物为 5' -GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'（SEQ ID NO. 5);
[0099] 反向引物为 5' -CTCCTTAAGTCACGCACGATTCC-3'（SEQ ID NO. 6)。
[0100] ⑵按照表1配制PCR反应体系：
[0101] 表1PCR反应体系
[0103] (3)卩〇?反应条件：95°(：1011^11，（951€308,60 1€408)\40个循环。以5￥81?6代611 作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和 电泳确定目的条带，△ ACT法进行相对定量。
[0104] 5、统计学方法
[0105] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0106] 6、结果
[0107] 结果如图1所示，与直肠腺癌非转移组织相比，MANBA基因在直肠腺癌转移组织中 的表达上调，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)，同RNA-sep结果一致。
[0108] 实施例3抑制MNBA基因表达
[0109] 1、细胞培养：人直肠腺癌细胞株SW480,以含10 %小牛血清和1 % P/S的DMEM培 养基在37°C、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0. 25%胰蛋 白酶常规消化传代。
[0110] 2、SiRNA 设计
[0111] 针对 MANBA 的 siRNA 序列：
[0112] siRNAl-MANBA ：
[0113] 正义链为 5' -AAAUCUGUAGUAAGAAUCCUG-3'（SEQ ID NO. 7);
[0114] 反义链为 5' -GGAUUCUUACUACAGAUUUAA-3'（SEQ ID NO. 8)，
[0115] siRNA2-MANBA ：
[0116] 正义链为 5' -UGCUAUAGGUCCAGUUAUCCA-3'（SEQ ID NO. 9);
[0117] 反义链为 5' -GAUAACUGGACCUAUAGCAAA-3'（SEQ ID NO. 10)，
[0118] siRNA3-MANBA ：
[0119] 正义链为 5' -AAUAGUGACUUCAUUGAACAG-3'（SEQ ID NO. 11);
[0120] 反义链为 5' -GUUCAAUGAAGUCACUAUUGG-3'（SEQ ID NO. 12)
[0121] 阴性对照 siRNA 序列（siRNA-NC):
[0122] 正义链为 5' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'（SEQ ID NO. 13);
[0123] 反义链为 5' -ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'（SEQ ID NO. 14)。
[0124] 将细胞按IX IO4/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2培养箱中细胞 培养24h，在无双抗、含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000 (购自 于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为阴性对照组（siRNA-NC)和实验组（20nM) (siRNAl-MANBA、siRNA2-MANBA、siRNA3-MANBA)，其中阴性对照组 siRNA 与 MANBA 基因的序 列无同源性，浓度为20nM/孔。同时分别转染。
[0125] 3、QPCR检测MANBA基因的转录水平
[0126] 3.1细胞总RNA的提取
[0127] 米用 TRIzol Reagent (Invitrogen Cat. No. 15596-018)总 RNA 提取试剂，按说明 书提供方法提取SW480细胞的总RNA。
[0128] 1)取细胞，用浓度为0.0 lM的PBS冲洗3次。
[0129] 2)加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀。