预扩增试验的制作方法
【专利说明】预扩増试验 相关申请的交叉参考
[0001] 本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请号61/987,921的优先权，在此 引入以供所有目的的参考。
【背景技术】
[0002] 核酸分析常常需要在进一步下游分析前扩增一条序列或一组序列。这可能是由于 被调查的序列在样品中是稀有的，或因为下游分析需要大量的起始材料。然而获自生物来 源或环境的样品可能包含抑制扩增的因子。此外，样品之间也有差异.例如来自一个个体 的血样可能比来自另一个个体的血样含有更多抑制因子，使得在第一种样品中预扩增步骤 效果更差。这些问题可能会使下游分析更困难，或导致样品间的不一致结果。
【发明内容】
[0003] 本文提供了能用于建立扩增反应效力的方法和成分。可在样品试验（assay)中加 入这些成分，作为扩增反应的内部对照。
[0004] 本文提供了检测第一核酸扩增反应中的状况（例如由于异常或抑制剂造成扩增 比预期少）的方法，该方法包括： 配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板（例如单链或双链核酸）、第二核 酸模板、和对第一核酸模板特异性的第一组引物（例如能与第一核酸模板杂交）； 对第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物（例如包含第一核酸模板的 扩增产物）； 配制第二混合物，其中第二混合物包含所述产物（例如所述产物的等份或稀释等份）、 对第二核酸模板特异性的第二组引物、和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组引 物； 对第二混合物进行第二扩增反应； 确定第一核酸模板扩增达到Cq所需循环数（Cql)和第二核酸模板扩增达到Cq所需循 环数（Cq2);和 当达到Cq2所需的循环数和达到Cql的循环数之间的差异（ACq)小于（例如小2%、 5%、10%、20%、30%、40%、1-20%、或5-30%)循环数阈值（例如当第一核酸模板和第二 核酸模板在第一混合物中以相同量存在时的第一循环数）时，在第一扩增反应中检测到状 况。
[0005] 在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在分开的核酸分子上。在一些 实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上不重叠的模板。参见例如图 1C。在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板是一条核酸分子上重叠的模板。参 见例如图ID。
[0006] 在一些实施方式中，第一混合物还包含样品（例如生物样品或其它怀疑含有感兴 趣核酸的样品）。在一些实施方式中，第一混合物还包含对样品核酸模板（例如包含于怀疑 的感兴趣核酸内的模板）特异性的第四组引物。在一些实施方式中，样品核酸模板包含遗 传变体（例如CNV、SNP或突变）。在一些实施方式中，第二混合物还包含对样品核酸模板特 异性的第五组引物。在一些实施方式中，第四和第五组引物是相同的。在一些实施方式中， 第四和第五组引物是不同的（例如与样品核酸模板上的不同序列互补，或不同地标记）。
[0007] 在一些实施方式中，第一扩增反应是多重的，例如设计为扩增多个样品核酸模板。 在一些实施方式中，第一混合物由此还包含对多条/种样品核酸模板特异性的多组引物。 在一些实施方式中，所述第二扩增反应是多重的。在一些实施方式中，第二混合物还包含对 获自第一扩增反应的样品核酸模板的扩增产物特异性的多组引物。在一些实施方式中，第 一扩增产物分成多种"第二"混合物，每种设计用于检测来自第一扩增反应的样品核酸模板 的一种或多种不同的扩增产物。
[0008] 在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在第一混合物中以等量存在。 在一些实施方式中，第一核酸模板和第二核酸模板在同一条核酸分子（单链或双链）上。在 一些实施方式中，第一和第二核酸模板长度相同，或长度差别在卜50个核苷酸内。在一些 实施方式中，第一和第二核酸模板长50-2000个核苷酸，例如80-120或100-500个核苷酸， 或长约100、200、250、300、500或750个核苷酸。
[0009] 在一些实施方式中，第一组引物与第三组引物相同。在一些实施方式中，第一和第 三组引物是不同的（例如与第一核酸模板上的不同或重叠序列互补，或不同地标记）。
[0010] 在一些实施方式中，所述第一扩增反应是PCR。在一些实施方式中，第一循环数在 1-25之间（例如4-10、5-15、2-8、6-20、10-24等）。在一些实施方式中，当达到Cq2所需循 环数和达到Cql所需循环数之间的差异比循环数阈值小约0. 01-5个循环（例如0. 1-1，小 于1、0. 01-2、3、4、5、2-5)时，检测到状况（例如异常或抑制）。在一些实施方式中，所述第 一扩增反应是逆转录。在一些实施方式中，第一核酸模板是RNA，而第二核酸模板是DNA。在 一些实施方式中，当达到Cq2所需循环数和达到Cql所需循环数之间的差异是0. 01-2(例 如第一和第二核酸模板量相等（或尽可能接近））时，检测到状况（例如异常或抑制）。在 一些实施方式中，第二扩增反应是PCR，例如qPCR (实时PCR或数字PCR)。在一些实施方式 中，进行第二循环数的第二扩增反应。在一些实施方式中，第二循环数相当于或大于第一循 环数。
[0011] 在一些实施方式中，在配制第二混合物前，至少部分从产物中除去第一组引物。在 一些实施方式中，产物在第二混合物中稀释至少2倍（例如5倍、10倍、20倍、10-100倍）， 例如作为等分的结果。
[0012] 还提供了在第一扩增反应中检测状况（例如比预期扩增少）的方法，该方法包 括： 配制第一混合物，其中第一混合物包含第一核酸模板、第二核酸模板、和对第一核酸模 板特异性的第一组引物； 对第一混合物进行第一循环数的第一扩增反应，产生产物； 配制第二混合物，其中第二混合物含有所述产物、进行第二核酸试验的试剂； 对第二混合物进行第二核酸试验； 测定第二混合物中第一核酸模板量的指示信号和第二混合物中第二核酸模板量的指 不?目号；和 当第二混合物中第一核酸量不显著高于第二核酸模板量（例如至少I. 5倍、2倍、5倍、 10倍、20倍等）时，检测到状况。
[0013] 在一些实施方式中，第二核酸试验是定量杂交试验。在一些实施方式中，进行第二 核酸试验的试剂包括对第一核酸模板或其互补物特异性的带标记探针或引物。在一些实施 方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第二核酸模板或其互补物特异性的带标记探针或 引物。在一些实施方式中，进行第二核酸试验的试剂包括对第一和第二核酸模板特异性的 带标记探针和/或引物。
[0014] 在一些实施方式中，第一混合物还包含样品（例如生物样品或其它怀疑含有感兴 趣核酸的样品）。在一些实施方式中，第一混合物还包含对样品核酸模板（例如包含于怀疑 的感兴趣核酸内的模板）特异性的一组引物。在一些实施方式中，样品核酸模板包含遗传 变体（例如CNV、SNP或突变）。
[0015] 还提供了在预扩增中检测状况（例如异常或抑制）的试剂盒。在一些实施方式 中，所述试剂盒包含：装有对第一核酸模板特异性的第一组引物的第一容器；装有对第二 核酸模板特异性的第二组引物的第二容器；和对第一核酸模板的扩增产物特异性的第三组 引物。在一些实施方式中，第三组引物在第二容器内。在一些实施方式中，容器是孔、管、包 装、可破裂包装（burst pack)或被包含和确定的区域（例如在表面上干燥）。
[0016] 在一些实施方式中，第一和第三组引物是不同的。在一些实施方式中，第一和第三 组引物是相同的。在一些实施方式中，试剂盒还包含对第一核酸模板的扩增产物特异性的 第一带标记探针。在一些实施方式中，试剂盒还包含对第二核酸模板的扩增产物特异性的 第二带标记探针。在一些实施方式中，试剂盒还包含对第一核酸模板的扩增产物特异性的 第一带标记探针，和对第二核酸模板的扩增产物特异性的第二带标记探针。
[0017] 在一些实施方式中，第二组引物中的至少一种引物被标记。在一些实施方式中，第 三组引物中的至少一种引物被标记。
[0018] 在一些实施方式中，该试剂盒还包含扩增酶。在一些实施方式中，试剂盒还包含第 一核酸模板和第二核酸模板，例如，在同一核酸分子（单链或双链）或在不同核酸分子（单 链或双链）上的第一核酸模板和第二核酸模板。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板 在至少一个独立容器内。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板在第一容器内。 附图简要说明
[0019] 图 1A、1B、IC 和 ID 描述了 PASIC (预扩增加标对照，PreAmp Spike-In Control) 技术的一些实施方式。图IA显示了 Cl和C2DNA模板与其各自的扩增引物。图IB显示了 PASIC实施方式的示范步骤。在预扩增混合物中加入Cl和C2模板和Cl扩增引物，用Cl模 板进行扩增。下游分析是实时PCR，同时使用两组引物。由于Cl模板经预扩增，Cl的定量 循环数（Cq)将在C2的Cq之前到达。图IC显示了可在一条核酸分子上用Cl和C2模板进 行该技术，其中Cl和C2模板不重叠。图ID显示了可在一条核酸分子上用Cl和C2模板进 行该技术，其中Cl和C2模板重叠。在上述任一个方面，当Cl和C2模板重叠，可用插入型 染料（例如SYBR绿）或寡核苷酸探针（例如TAQMN或分子信标探针）进行qPCR定量检 测。当Cl和C2重叠时，在使用寡核苷酸探针的实施方式中，可以对Cl和C2模板使用不同 探针，或可使用同时检测Cl和C2模板扩增子的共同探针。
[0020] 图2A、2B、2C、2D和2E显示了使用PASIC扩增TBP (TATA结合蛋白）的代表性数据。 这些图显示了在血液（图2B)或巧克力提取物（图2C)样品上进行的预扩增，其水平是在 某些情况下已知抑制实时PCR(图2C)，或在无抑制剂的对照（图2A)上进行的预扩增。预 扩增进行10轮循环。Cql和Cq2分析显示血液并不抑制预扩增，因为Cq(Cq2_Cql)和没有 抑制剂的对照一样，为9. 6。相反，巧克力提取物显著抑制预扩增，其Cq是0.3。后一结果 显示Cl模板在预扩增中并未被显著扩增。图2D和2E显示了在血样和无抑制剂对照中TBP 表达似乎一样（图2D中轨迹重叠），而巧克力提取物样品与无抑制剂对照相比，TBP表达似 乎低得多（图2E中对于巧克力提取物更高的Cql和Cq2)。 发明详述 A.引g
[0021] 本文提供了测定预扩增反应是否有效、如何有效、在特定样品中是否存在抑制因 子的方法和组合物