。预扩增是设计用于扩增（例如通过PCR，一些其它扩增方法，或逆转录） 目标核酸然后用于下游分析的技术。下游分析技术包括定量试验，例如qPCR(例如数字PCR 或实时PCR)、高分辨率解链分析、分子信标试验、杂交试验和测序反应。
[0022] 例如，在标准核酸分析中，包含核酸的样品可与如下物质混合：（i)设计扩增目标 核酸节段的DNA引物，（ii)聚合酶，例如Taq或其它扩增酶（RNA或DNA聚合酶或转录酶）， 以及（iii)合适的试剂（例如dNTP、缓冲液等）。预扩增后，将产物（可任选稀释或处理以 分离扩增产物）加到下游分析反应中。预扩增步骤提高可用于进一步分析的目标核酸量， 因此能用于检测、定量、和分析稀有序列（例如低拷贝数突变）。
[0023] 本发明的方法和组合物可用作预扩增和随后分析的内部对照。在这种情况下，内 部对照方法称作PASIC (预扩增加标对照）。PASIC可用于涉及qPCR，测序，检测表达水平， 检测SNP、CNV或其它遗传变体的下游分析。
[0024] 当用作怀疑含有待预扩增目标核酸的样品的内部对照时，混合入（i)第一和第二 已知模板（例如合成或重组产生的核酸分子）（加标），以及（ii)对第一模板特异性的扩增 引物，（iii)对目标核酸特异性的扩增引物，和（iv)合适的试剂（例如聚合酶、dNTP、缓冲 液等）。进行预扩增反应。如果在样品或反应中存在抑制剂或一些其它异常，不会如预期那 样多地扩增第一模板。这可在本文所述的下游过程（例如第二扩增反应）中测定。第一模 板扩增中检测到异常表示样品中的目标核酸可能也不会被有效预扩增。
[0025] 在一些实施方式中，预扩增是对DNA模板，并使用例如PCR。在一些情况下，预扩增 进行约4-24轮（例如10-20、10-24、5-15轮等）循环，视目标核酸的期望浓度以及反应中 的第一和第二模板量而定。第二模板不在预扩增中扩增。然而，在下游处理步骤（例如定 量扩增反应）中存在同时对第一和第二模板特异性的引物。
[0026] 假设第二核酸试验是定量PCR，而第一混合物中第一和第二核酸模板量相等。如果 预扩增完美进行，在第二扩增中达到第二模板扩增产物预定浓度所需的循环数将比获得相 同浓度第一模板扩增产物所需的循环数多出预扩增循环数。用户可决定确定"异常"的阈 值。例如，如果预扩增进行10轮，在第二扩增中确定为异常的阈值可定为约9轮（例如在 约1或2轮内，8. 5、8. 75、9. 1、9. 2、9. 4、9. 5、9. 6、9. 7等）。换言之，如果第二模板扩增产物 在第二扩增中于少于9轮的循环内达到与第一模板扩增产物的相同浓度，预扩增被确定为 异常。
[0027] 在多重反应中可用预扩增对照，在一些实施方式中，可将来自预扩增（第一扩增） 的产物分成多个"第二"核酸试验。例如，预扩增反应可包含多组对样品中不同靶核酸特异 性的扩增引物。在一些实施方式中，将预扩增产物分成用于多种下游分析，例如每种针对样 品中一种或多种不同靶核酸，以及针对第一和第二核酸模板对照。
[0028] 例如，预扩增反应可包含上面列出的那些要素：⑴第一和第二已知模板（例如相 等或已知量）；（ii)对第一模板特异性的扩增引物，（iii)怀疑含有靶核酸的样品；（iv)对 靶核酸特异性的扩增引物；和（V)合适的试剂（扩增酶、核苷酸、缓冲液等）。然后进行预 扩增产生产物。假定预扩增成功，样品中至少包含一些靶核酸，产物将会包含来自样品的靶 核酸和第一核酸模板的扩增产物。可将第一扩增的产物加入到单种反应混合物中用于第二 核酸分析，或可分配在多根试管（或孔、容器或位置）用于第二核酸分析。例如，如果第二 核酸分析是qPCR，反应混合物可包含第一核酸模板扩增产物特异性引物，第二核酸模板特 异性引物，多组靶核酸扩增产物特异性引物，以及合适的试剂。或者，可分配产物，使得每种 反应混合物包含第一核酸模板扩增产物特异性引物，第二核酸模板特异性引物，对一种或 一亚组来自样品的靶核酸扩增产物特异性的引物，以及合适的试剂。
[0029] 在一些实施方式中，第一扩增是逆转录反应。这种情况下，第一核酸模板是RNA，第 一组引物可以仅包含一种引物，例如聚-T寡核苷酸或对已知的第一核酸模板特异性的寡 核苷酸序列。逆转录反应可包括已知的第一核酸模板（RNA)，已知的第二核酸模板（RNAS DNA)，怀疑包含靶RNA模板的样品，第一核酸模板特异性引物，靶RNA模板特异性引物，和合 适的试剂（例如逆转录酶、dNTP，缓冲液等）。在一些实施方式中，第二核酸分析是PCR，第 二核酸反应混合物包含逆转录反应的产物，第一核酸模板扩增产物特异性引物，第二核酸 模板特异性引物，来自样品的靶核酸扩增产物特异性引物，以及合适的试剂。假定第一 RNA 模板和第二核酸模板的量在逆转录反应中已知，可计算确定异常的阈值。这种变化也适用 于多重试验，用于检测样品中的多种目标。
[0030] 可根据许多可控因子预测性计算确定预扩增中异常的阈值。这些包括但不限于预 扩增中第一和第二核酸模板的相对浓度，对各模板特异性的引物的可得性，第一和第二模 板的相对长度以及G-C含量。在一些实施方式中，预扩增中第一和第二核酸模板的浓度是 相等的（例如两种模板存在于一条核酸上），第一和第二模板长度相同（例如约50-500个 核苷酸，80-150个核苷酸，或约100-200个核苷酸）或在几个核苷酸（例如在1-10%的总 长度内）的差异内。在一些实施方式中，第一和第二核酸模板的GC含量相同，或在2-5个 核苷酸的差异内。
[0031] 在一些实施方式中，包含第一和第二已知核酸模板以及第一核酸模板特异性探针 的预扩增反应与样品的预扩增反应并列进行，例如在分开的孔或多孔板中，或在分开的试 管中进行。在一些实施方式中，对于多重、相继的预扩增反应，包含第一和第二已知核酸模 板以及第一核酸模板特异性探针的预扩增反应在对照孔中进行。
[0032] 如果确定当包含样品时预扩增异常，用户可回到样品并尝试将核酸与非核酸物质 分离，例如使用层析方法或通过沉淀和重悬浮核酸，或加入试剂中和可疑污染物。如果确定 预扩增在不存在样品时是异常的，用户可检查例如扩增仪器的温度、湿度等。不论何种情 况，用户可检查以确保所有的合适的试剂被加入到预扩增反应中。 B.定义
[0033] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通 常所理解的同样含义。这些术语和标准技术描述于例如：Lackie，细胞和分子生物学字 典，Elsevier (第四版 2007) ;Sambrook 等，分子克隆：实验手册，Cold Springs Harbor Press (冷泉湾，NY 1989);寡核苷酸合成（Gait编，最新版）；核酸杂交（Hames&Higgins 编，最新版）；转录和翻译（Hames&Higgins编，最新版）；细小病毒CRC手册，卷 I&II (Tijessen编）；基础病毒学，第二版，卷I&II (Fields和Knipe编）所述。术语"一个" 或"一种"意在表示"一个（种）或多个（种）"。当术语"包含"及其各种变体例如"包括" 和"含有"位于叙述步骤或元素之前的时候，是用来表示可任选地添加其它步骤或元素，是 非排它性的。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明 的范围构成限制。
[0034] 本文所用的扩增反应中的"状况"或"异常"指任何导致扩增水平比对于已知模板、 模板浓度和扩增条件所预测的低的因素。例子包括那些限制扩增的因素，例如对扩增酶活 力的干扰或活性减低，或对引物或模板的干扰。异常还可能是由于会影响扩增的仪器或反 应的问题（例如没有达到变性温度等）。除非另外说明，异常并不是指对一种目标样品核酸 预扩增特异性的问题，例如对所需模板的染色质干扰或样品模板中难以扩增的重复序列。
[0035] "循环"指扩增循环，通常包括引物与模板核酸杂交，引物延伸/聚合，模板和新形 成的链变性。在PCR中，每一轮循环使得模板量倍增，重复循环导致模板对数扩增（[模板] X 2n,其中η =循环数）。
[0036] 术语"定量循环"（Cq)指达到设定阈值荧光信号（例如定量扩增反应的定量区） 所需的循环数。选择阈值水平在反应对数期内捕获数据。为了确定Cq值，可从原始荧光数 据中扣除背景荧光水平。背景可基于开始几轮循环在可检测扩增之前的最初稳定的荧光水 平。在一些实施方式中，用仪器专用算法或手工选择荧光阈值。对每一个样品用数据分析 法搜寻数据曲线，并从阈值内推出该样品的Cq值。具体Cq是相对值，相对于起始模板拷贝 数，且对仪器、试剂、扩增效率以及反应灵敏度等是特异性的。越低Cq表明起始模板量越 高，扩增越有效等。
[0037] 本文所用的"样品"指怀疑携带感兴趣核酸的标本。样品可以是生物学样品，或从 环境中回收的，例如从表面拭得，食物样品，来自水处理设施等。可在试验之前对样品进行 加工以例如去除非核酸碎片。该术语包含获得后经处理的样品，如试剂处理、溶解、沉降或 对某些组分的富集。感兴趣的核酸可以是遗传变体（例如拷贝数变体，多态性，或突变），表 达产物（例如RNA或其扩增产物），或来自感染介质（例如细菌、噬菌体、病毒或真菌）。
[0038] 本文所述的"阈值"是用户根据特定试验条件选择的一个数值，用于确定预扩增反 应是否有某种异常，例如不是最佳或根据能够控制的条件（例如模板浓度和长度，引物浓 度等）比起预期的要低。在一些实施方式中，阈值指第一和第二模板扩增的A Cq与已知扩 增循环数（例如在预扩增步骤中的循环数）之间可容忍的差异。在一些实施方式中，阈值 指一个反应内（例如在定量杂交或测序反应内测定的）第一和第二核酸量之间可容忍的差 异。在一些实施方式中，阈值指反应内第一和第二核酸量之间的预期差与定量试验中实测 量之间可容忍的差异。在一些实施方式中，阈值允许离预期值1-20%变动（例如1-10%、 1-5%、5-10%变动）。例如，如果预期的第一和第二模板扩增的Cq是10,用于确定存在异 常的阈值可定为〇. 1-2循环，例如约0. 5循环。
[0039] 术语"生物样品"包括从生物体中得到的多种样品类型。该术语包括体液，如血液、 血液组分、唾液、血清、血浆、尿液和其它生物来源的液体样品、固体组织活检、组织培养物 或取自培养细胞的上清。可在试验之前对生物样品进行加工以例如去除细胞或细胞碎片。 该术语包含获得后经处理的