一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法。
【背景技术】
[0002] 无机焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase, PPase, EC3. 6. I. 1)是一类能够催化 焦磷酸水解为正磷酸的酶。焦磷酸（Pyrophosphoric acid，PPi)是生物体内DNA和RNA聚 合、氨基酸活化、氨酰tRNA合成、脂肪酸的β -氧化、脂酰辅酶A合成、纤维素合成、葡萄糖 合成以及淀粉合成等过程的副产物，PPase通过分解PPi可使上述反应向合成方向进行并 为多种生物合成反应提供能量。PPase广泛存在于自然界，在动物、植物和微生物中均有发 现，并随着技术手段的发展，现已成功地从日本吸血虫、水稻、大麦、烟草、酵母、枯草芽胞杆 菌、大肠杆菌以及嗜热细菌中获得了 PPase的cDNA克隆。生物体内存在无机焦磷酸酶共分 为四类：膜结合的无机焦磷酸酶（H+-PPase)和可溶性的家族Ι、ΙΙ、ΙΙΙ三类无机焦磷酸酶。 根据其细胞定位与亚基结构，PPase在催化反应中，需要结合三或四个2价金属阳离子，例 如二价镁离子（Mg 2+)。PPase在体外具有增强DNA聚合酶的扩增效率以及增强RNA聚合酶 在体外转录反应中的产量的功能。除此之外，PP ase在焦磷酸测序等DNA测序技术中发挥 重要作用。
[0003] 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing)是利用生物发光反应进行序列测定的新一代 测序技术。其基本原理为：在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP)中 的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其 掺入到测序引物链的3'末端，同时释放出一分子的PPi ;在ATP硫酸化酶的作用下，生成的 PPi可以和5' -磷酰硫酸（Adenosine-5' -phosphosulfat，APS)结合形成等量的腺噪呤核 苷三磷酸（ATP);生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同 时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则 和相匹配的碱基数成正比；如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反 应不会发生，也就没有检测峰；反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双 磷酸酶（Apyrase)的作用下发生降解；待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应 重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。近年来出现了一种高通量光 导纤维微反应池阵列焦磷酸测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了 测序技术的革命，极大地推动了后基因组计划的发展。在上述高通量焦磷酸测序技术中，除 了 DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶以外，PPase是另一个重要 用酶，其作用是通过清除多余的PPi来减少每一轮碱基加入期间反应仓微孔之间的交叉干 扰，并且能够降低测序反应中的背景噪音。
[0004] 用于高通量焦磷酸测序技术的PPase需要被固定在微球表面，实现固定化的常用 手段是将酶蛋白经过生物素标记后，通过与微球表面的链亲和素反应，从而被固定在微球 表面。这就需要对PPase进行生物素化修饰。目前，通过化学手段能够实现蛋白质的生物 素化修饰，其原理是通过化学反应将生物素连接到蛋白质中赖氨酸残基的游离氨基上。酶 作为一种生物活性蛋白质，对有机试剂等因素非常敏感，然而在化学修饰过程中常常需要 引入大量有机试剂，存在使酶活性降低甚至丧失的可能性；在化学修饰的过程中，如果处于 蛋白质活性中心的赖氨酸残基被修饰，也很可能影响到酶蛋白质的催化活性；此外，化学修 饰法还存在操作繁琐和产物不均一的缺点。
[0005] 因此，提供一种PPase的生物素化修饰方法，使其能够直接在细胞内被生物素修 饰，能有效避免化学修饰法的缺陷或不良影响，同时增强其在焦磷酸测序技术中的实际应 用性。
【发明内容】
[0006] 除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的 普通技术人员通常理解的相同意义。
[0007] 本发明中的术语"BAP23"指序列为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的生物素受体 蛋白。
[0008] 本发明要解决的问题是提供一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，以实现无 机焦磷酸酶在宿主细胞内的生物素化修饰，为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如 下：
[0009] -种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，其中：使用一种由23个氨基酸残基组成 的生物素受体蛋白BAP23,将该生物素受体蛋白的编码基因构建到大肠杆菌表达载体中，获 得一种携带上述生物素受体蛋白编码基因的重组表达载体，当无机焦磷酸酶的编码基因构 建到上述重组表达载体中后，能够表达该生物素受体蛋白和无机焦磷酸酶的融合蛋白，该 融合蛋白能够在大肠杆菌细胞内被生物素化修饰。
[0010] 其中，所述的生物素受体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示：
[0011] MAQRLFHILDAQKIEffHGPKGGS
[0012] -种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，包括以下步骤：
[0013] ⑴.合成生物素受体蛋白BAP23的编码基因；
[0014] ⑵.将步骤⑴合成的生物素受体蛋白BAP23的编码基因构建到大肠杆菌表达载体 中，获得重组表达载体A ;
[0015] ⑶.将无机焦磷酸酶的编码基因构建到步骤⑵所得的重组表达载体A中，获得重 组表达载体B ;
[0016] ⑷.用步骤⑶所得的重组表达载体B转化大肠杆菌宿主细胞，获得重组基因工程 菌A;
[0017] (5).以步骤⑷所得的重组基因工程菌A作为生产菌株，进行诱导表达培养。
[0018] 本发明所述的表达方法步骤⑴中所述的BAP23编码基因的核苷酸序列可以为SEQ ID NO :2所示的序列。但根据本领域公共知识，密码子具有简并性，编码同一种氨基酸可以 有几种不同的密码子，因此本发明所述的BAP23的编码基因序列并不局限于SEQ ID NO :2 所示的核苷酸序列。
[0019] 本发明所述的表达方法步骤⑵中的大肠杆菌表达载体为pMAL-p4E、pMAL-p4X、 pMAL-p5E、pMAL-p5X、pET22b (+)、pET28a (+)、pET30a (+)和 pET32a (+)中的任意一种；优选 为pMAL-p4E、pMAL-p5E、pET28a(+)和pET30a(+)中的任意一种；进一步优选为pMAL-p4E和 pET30a(+)中的任意一种；最优选为pET30a(+)。
[0020] 本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因可以通过PCR 扩增或化学全合成的方式获得。
[0021] 本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因应当与BAP23 的编码基因位于同一多克隆位点区。
[0022] 本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因可以构建到 BAP23的编码基因的上游或下游；优选为上游。
[0023] 当本发明所述的表达方法步骤⑶中所述的无机焦磷酸酶的编码基因位于BAP23 的编码基因上游时，应当去掉无机焦磷酸酶的编码基因的终止密码子。
[0024] 本发明所述的表达方法步骤⑷中所述的大肠杆菌宿主细胞可以为 E. coliRosetta(DE3)。但根据本领域公共知识，功能基因连接到各类载体获得的重组载体， 转入适当宿主细胞，在一定条件下均可实现目的蛋白的表达，因此本发明所述的大肠杆菌 宿主细胞并不局限于E. coliRosetta(DE3)。
[0025] 本发明所述的表达方法步骤(5)中所述的诱导表达培养的方法为：挑取生产菌株单 菌落接种于LB培养基，37°C培养24h，获得种子液；将上述种子液以1% (v/v)的接种量接 种于TB培养基，37°C培养3小时后，加入终浓度为0. 05mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，30°C培养 16h。
[0026] 按照本发明所述的表达方法表达的生物素化无机焦磷酸酶可以根据所选用的大 肠杆菌表达载体上带有的亲和层析标签，选择相应的亲和层析柱进行纯化。当使用的大肠 杆菌表达载体为pMAL_p4E、pMAL_p4X、pMAL_p5E和pMAL_p5X时，可以选用Amylose亲和层 析柱进行纯化；当使用的载体为pET22b (+)、pET28a (+)、pET30a (+)和pET32a (+)时，可以 选用组氨酸亲和层析柱进行纯化。
[0027] 本发明的有益效果：
[0028] 本发明提供了一种生物素化无机焦磷酸酶的表达方法，该表达方法实现了无机焦 磷酸酶在宿主细胞内的生物素化修饰。表达的生物素化无机焦磷酸酶的催化活力与未进 行融合表达的相同无机焦磷酸酶相比较，没有发生变化。按照本发明提供的表达方法表达 的生物素化无机焦磷酸酶的产量达到21~38mg/100mL培养基；表达的生物素化无机焦磷 酸酶的比活力达到94. 2~151. 6U/mg ;表达的生物素化无机焦磷酸酶被磁珠固定后得到的 Bead-LUC被反复洗涤3次后，催化活力几乎不受影响，被反复洗涤6次后，能够维持相较于 洗涤前97%以上的相对活力，在反复洗涤9次后，能够维持相较于洗涤前94%以上的相对 活力，在反复洗涤15次后，能够维持相较于洗涤前91%以上的相对活力。
【附图说明】
[0029] 图1为插入了生物素受体蛋白BAP2