3编码基因和无机焦磷酸酶编码基因的 pET30a(+)质粒图谱。其中，BAP23编码基因位于无机焦磷酸酶编码基因的上游。
[0030] 图2为生物素化无机焦磷酸酶酶的表达结果。其中M为蛋白质分子量标准；Lanel 为实施例1步骤(5)所述的表达结果，黑框中为按照实施1的方法表达的生物素化无机焦磷 酸酶。
[0031] 图3为插入了生物素受体蛋白BAP23编码基因和无机焦磷酸酶编码基因的 pET22b(+)质粒图谱。其中，无机焦磷酸酶编码基因位于BAP23编码基因的上游，无机焦磷 酸酶编码基因已通过反向引物去掉了终止密码子。
[0032] 图4为生物素化无机焦磷酸酶的表达结果。其中M为蛋白质分子量标准；Lanel为 实施例3步骤(5)所述的表达结果，黑框中为按照实施3的方法表达的生物素化无机焦磷酸 酶。
[0033] 图5为生物素化无机焦磷酸酶酶的表达结果。其中M为蛋白质分子量标准；Lanel 为实施例5步骤(5)所述的表达结果，黑框中为按照实施5的方法表达的生物素化无机焦磷 酸酶。
[0034] 图6为测活标准曲线。其中X为PO43浓度，y为700nm处的吸光度。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行； 所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本领域技术人员应该理解的 是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替 换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0036] 本发明涉及的以下英文名称的含义为：Bead-PPase指被固定到磁珠上的无机焦 磷酸酶；Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷（Tris)和盐酸配制的缓冲液；Tris-Ac指利用 三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制的缓冲液；Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷（Tris)和盐 酸配制的缓冲液；Η)ΤΑ指乙二胺四乙酸；BSA指牛血清白蛋白；DTT指二硫苏糖醇；PVP指聚 乙烯吡咯烷酮。
[0037] 本发明所用宿主菌株E. coliRosetta (DE3)和E. coli BL21(DE3)感受态细胞以及 质粒pET22b(+)和pET30a(+)购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；PPASE重 组质粒由北京中科紫鑫科技有限责任公司提供；限制性内切酶购于NEB公司；DNA凝胶回 收试剂盒与PCR产物清洁试剂盒购自Axygen公司；核酸序列的化学合成由上海生工生物 工程公司完成；组氨酸亲和层析柱购自GE Healthcare公司，型号为17-5248-01 ;超微量 蛋白浓度测定仪购自Nanodrop公司，型号为ND2000 ;磁珠混悬液购自Invitrogen公司，型 号为DynaBeads TM_280Strep tavidin ;分光光度计购自上海谱元仪器有限公司，型号为 Alphal506 ;其余试剂购自Sigma-Aldrich公司。
[0038] 实施例1生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
[0039] 包括以下步骤：
[0040] (1).在SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入Nco I和Hind III 的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，命名为序列 BAP23-1，化学全合成序列BAP23-1 ;
[0041] (2) ·用限制性内切酶Nco I和Hind III酶切pET30a(+)质粒和实施例1步骤⑴所 得序列BAP23-1，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列BAP23-1 和pET30a(+)质粒于16°C连接过夜，获得重组表达载体Al ;
[0042] ⑶·设id 对引物特异性引物，以·热球菌Thermococcus Iitoralis基因组DNA 为模板，PCR扩增其中无机焦磷酸酶（GenBank编号为WP_004067338)的编码基因并用PCR 清洁试剂盒回收PCR产物；正向引物的序列如SEQ ID NO :4所示，其酶切位点为Hind III ; 反向引物的序列如SEQIDN0:5所示，其酶切位点为XhOI;PCR程序为：95°C变性5min， 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，34个循环，最后72°C延伸IOmin ;
[0043] (4).用限制性内切酶Hind III和Xho I酶切实施例1步骤⑶所得的纯化后的无机 焦磷酸酶编码基因和实施例1步骤⑵所得重组表达载体A1，将酶切后的无机焦磷酸酶编码 基因和重组表达载体Al于16°C连接过夜，获得重组表达载体B1，其图谱如图1所示；
[0044] (5).用实施例1步骤⑷所得重组表达载体Bl转化E. coliRosetta (DE3)感受态细 胞，获得重组基因工程菌Al ;
[0045] (6).挑取实施例1步骤(5)所得重组基因工程菌Al单菌落接种于5mL含有终浓度 为50 μ g/mL的卡那霉素的LB培养基中，37°C培养24h，获得种子液；将上述5mL种子液全 部接种于500mL含有终浓度为50 μ g/mL的卡那霉素的LB培养基中，37°C培养3小时后，加 入终浓度为0. 05mM的IPTG，30°C诱导培养16h，表达结果如图2所示。
[0046] 实施例2生物素化无机焦磷酸酶的纯化
[0047] 按照实施例1的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶，利用组氨酸亲和层析柱进行 纯化。
[0048] 纯化方法包括以下步骤：
[0049] (1).离心收集实施例1步骤(6)诱导培养后的菌体，超声波破碎菌体，将破碎液于 4°C、12000rpm/min，离心 30min，收集上清液；
[0050] (2).使用5倍柱床体积的平衡缓冲液（50mM pH8. 0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠 +2mM咪唑）平衡组氨酸亲和层析柱；
[0051] ⑶.将实施例2步骤⑴所得上清液以lmL/min的流速加入组氨酸亲和层析柱，使 生物素化无机焦磷酸酶挂柱；
[0052] ⑷.用15倍柱床体积的漂洗缓冲液（50mM pH8. 0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠 +5mM咪唑）漂洗层析柱至基本无杂蛋白；
[0053] (5).用洗脱缓冲液液（50mM pH8. 0磷酸钠缓冲液+300mM氯化钠+50mM咪唑）洗 脱目的蛋白，并以lmL/tube的体积收集目的蛋白；
[0054] 采用超微量蛋白浓度测定仪测定纯化后的生物素化无机焦磷酸酶的浓度，约为 7. 6mg/mL〇
[0055] 实施例3生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
[0056] 包括以下步骤：
[0057] ⑴.在SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入BamH I和Xho I 的酶切位点以及相应保护碱基，得到如SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列，命名为序列 BAP23-2,化学全合成序列BAP23-2 ;
[0058] (2).用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切pET22b (+)质粒和实施例3步骤⑴所 得序列BAP23-2,并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的核苷酸序列BAP23-2 和pET22b (+)质粒于16°C连接过夜，获得重组表达载体A2 ;
[0059] ⑶.设计一对引物特异性引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，PCR扩增其中无机 焦磷酸酶（GenBank编号为NP_009565)的编码基因并用PCR清洁试剂盒回收PCR产物；正 向引物的序列如SEQ ID NO :7所示，其酶切位点为Nde I ;反向引物的序列如SEQ ID NO :8 所示，其酶切位点为BamH I ;PCR程序为：95°C变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C 延伸lmin，34个循环，最后72°C延伸IOmin ;
[0060] ⑷.用限制性内切酶Nde I和BamH I酶切实施例3步骤(3)所得的纯化后的无机 焦磷酸酶编码基因和实施例3步骤⑵所得重组表达载体A2,将酶切后的无机焦磷酸酶编码 基因和重组表达载体A2于16°C连接过夜，获得重组表达载体B2,其图谱如图3所示；
[0061] (5).用实施例3步骤⑷所得重组表达载体B2转化E. coliBL21 (DE3)感受态细胞， 获得重组基因工程菌A2 ;
[0062] (6).挑取实施例3步骤(5)所得重组基因工程菌A2单菌落接种于5mL含有终浓度 为100 μ g/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养24h，获得种子液；将上述5mL种子液 全部接种于500mL含有终浓度为100 μ g/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养3小时 后，加入终浓度为0. 05mM的IPTG，30°C诱导培养16h，表达结果如图4所示。
[0063] 实施例4生物素化无机焦磷酸酶的纯化
[0064] 按照实施例3的方法表达的生物素化无机焦磷酸酶，利用组氨酸亲和层析柱进行 纯化。
[0065] 纯化方法同实施例2 ;采用超微量蛋白浓度测定仪测定纯化后的生物素化无机焦 磷酸酶的浓度，约为6. 9mg/mL。
[0066] 实施例5生物素化无机焦磷酸酶的表达方法
[0067] 包括以下步骤：
[0068] (1).在SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的上游和下游分别引入Nco I和EcoR I 的酶切位点以及相应保护碱