双特异性构建体及其用于治疗多种疾病的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特异性结合免疫效应细胞，同时结合IL23R携带性靶标细胞的双特异 性构建体，以及核酸、载体、宿主细胞、药物组合物及其产生和使用方法，包括所述双特异性 构建体用于治疗炎症性和/或自身免疫疾病和/或癌症的用途。
【背景技术】
[0002] 白介素（Interleukin，IL)-23是一种包含两个蛋白质亚单位（根据它们的近似分 子量而指定为P40和pl9)的异二聚细胞因子。p40蛋白于IL-12与IL-23之间共用，而pl9 蛋白亚单位为IL-23所特有。IL-23通过由结合p40的IL-12受体f3-l(IL-12RM)链和 赋予IL-23特异性细胞内信号传导的独特IL-23受体链（IL23R)组成的双链受体复合物进 行信号传导。
[0003] IL-23诱导幼稚CD4+T细胞分化成产生病原性IL-17的辅助T (Thl7或Th1^7)细 胞。由这个独特辅助T细胞子组分泌的IL-17是炎症期间的一种重要效应物细胞因子。已 观察到在各种自身免疫疾病和炎症性病状，包括类风湿性关节炎、炎症性肠病（即克罗恩 氏病（Crohn' s disease)和溃疡性结肠炎）和牛皮癣的靶标组织中，IL-17水平升高。因 此，IL-23已被暗示为炎症性病状和自身免疫介导的疾病中的关键因子。
[0004] 作为用于治疗炎症性和自身免疫疾病的潜在治疗方法，迄今为止已测试若干用以 靶向IL-23/IL-17信号传导的方法，包括针对IL-23或IL-23受体的抗体。关于使用IL-23 作为潜在药理学干预的靶标，已开发各种针对IL-23的p40亚单位的中和抗体供潜在用于 治疗自身免疫驱动的疾病。举例来说，称为"优特克单抗（ustekinumab) "(Janssen-Cilag) 的单克隆抗体是靶向IL-12和IL-23的共同p40亚单位的抗体。它已显示有效治疗牛皮癣 和牛皮癣性关节炎。靶向IL-23的较小pl9亚单位的另一单克隆抗体描述于EP 2548577 中。
[0005] 关于旨在通过IL-23受体靶向性抗体阻断IL-23受体功能的策略，W02004/042009 公开使用单克隆抗IL-23受体抗体或其片段（Fv、Fab、Fab'和F(ab'）2)治疗与IL-17的表 达升高相关的炎症性疾病。此外，W02008/106134公开识别人IL-23受体的IL23R链，适用 于治疗炎症性和自身免疫病症的人源化抗体的产生。这些抗IL23R抗体尤其包括可在免疫 疗法中用于选择性靶向以及杀灭在它们的表面上表达IL23R的细胞的缀合于细胞毒性有 效载荷的抗体。
[0006] -种用于基于抗体来治疗各种癌症疾病的有前途方法是，使用双特异性抗体使免 疫效应细胞重定向以特异性溶解革巴标细胞。双特异性抗体识别革巴标细胞的表面上的特定抗 原，同时免疫效应细胞（如自然杀伤（NK)细胞或细胞毒性T (Tc)细胞）的活化性表面分子 以由此杀灭靶标细胞。
[0007] 双特异性抗体构思被例如用于癌症疗法中，其中采用结合癌细胞上的癌症抗原以 及同时结合例如细胞毒性T细胞上递呈的CD3的ε链的双特异性抗体。所述双特异性 抗体构建体的一熟知实例是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin' s lymphoma)和 急性成淋巴细胞性白血病的作为呈BiTE(双特异性T细胞衔接物（bi-specific T cell engager))形式的抗体的"兰妥莫单抗（blinatumomab)"兰妥莫单抗由Micromet开发，并 且同时结合癌症抗原CD19以及细胞毒性T细胞的表面上的CD3,由此将这两种细胞类型联 系在一起，并且活化细胞毒性T细胞以溶解靶标癌细胞。
[0008] 迄今最成功的用以治疗炎症性和/或自身免疫疾病的抗体基方法利用了干扰细 胞因子和它们的相应受体的相互作用以阻止通过细胞因子受体进行信号传导的作用机理。 实例包括抑制TNFa (例如英夫利昔单抗（infliximab)和阿达木单抗（adalimumab))、抑制 p40(例如优特克单抗）或抑制IL6R(例如托珠单抗（tocilizumab))。然而，这些抗体常仍 然允许通过多种路径进行信号传导。因此，很多患者不能被有效治疗。举例来说，多达40% 的患者难以用TNFa抑制性抗体治疗。
[0009] 因此，在如炎症性和/或自身免疫疾病以及癌症的各种疾病的治疗中，仍然需要 新型和改进治疗策略。具体来说，要求用于所述治疗的双特异性分子是稳定的，易于生产， 对给定靶标抗原具有高度特异性，并且具有低免疫原性。
【发明内容】
[0010] 本发明通过以下方式来满足以上提出的需要：提供特异性结合免疫效应细胞（即 细胞毒性效应T(Tc)细胞）以及同时结合IL-23受体表达性靶标细胞（例如病原性IL-17 产生性辅助T细胞（Thl7细胞））以杀灭IL-23受体表达性靶标细胞的双特异性构建体。 [0011] 在第一方面，本发明提供一种用于治疗包含IL23R表达性肿瘤细胞的癌症的包含 至少一个第一结合部分和至少一个第二结合部分的双特异性构建体，其中所述第一结合部 分特异性结合细胞毒性效应T(Tc)细胞上存在的第一抗原，并且所述第二结合部分特异性 结合IL-23受体特异性亚单位（IL23R)。
[0012] 在第二方面，本发明提供一种包含至少一个第一结合部分和至少一个第二结合部 分的双特异性构建体，其中所述第一结合部分特异性结合细胞毒性效应T (Tc)细胞上存在 的第一抗原，并且所述第二结合部分特异性结合靶标细胞的表面上存在的IL-23受体特异 性亚单位（IL23R)。
[0013] 在其它方面，本发明也提供一种或多种编码本发明的双特异性构建体的核酸、以 及一种或多种包含所述核酸的载体和一种或多种包含所述载体的宿主细胞。
[0014] 本发明的另一方面涉及一种用于产生本发明的双特异性构建体的方法，其包括 α)提供一种或多种本发明的核酸、或一种或多种本发明的载体，该载体表达所述核酸或所 述载体，以及从表达系统收集所述双特异性构建体，或αυ提供一种或多种本发明的宿主 细胞，培养所述一种或多种宿主细胞，以及从细胞培养物收集双特异性构建体。
[0015] 本发明的另一方面涉及一种包含本发明的双特异性构建体以及药学上可接受的 载体的药物组合物。
[0016] 在另一方面，本发明涉及本发明的双特异性构建体用于治疗炎症性和/或自身 免疫疾病，或在治疗炎症性和/或自身免疫疾病的方法中的用途，所述方法包括向受试者 施用有效量的本发明的双特异性构建体。示例性炎症性和/或自身免疫疾病包括类风湿 性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病（Crohn' s disease)、全身性红斑狼疮、青少年糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、多发性硬化症、帕金森氏病 (Parkinsor^ s disease)、阿尔茨海默氏病（Alzheimei^ s disease)和缺血-再灌注损 伤。
[0017] 本发明的特定实施方案阐述于随附附属性权利要求中。
【附图说明】
[0018] 图I :A :IL23信号传导和Thl抗肿瘤应答；B :提出的双特异性抗IL23RX⑶3 ε抗 体相互作用机理；
[0019] 图2 :IL23R在结肠癌细胞系上的表达。通过初级山羊多克隆抗IL23R抗体和PE 标记的抗山羊抗体来检测IL23R表达。实线：IL23R表达；虚线：同种型对照。X轴，PE强 度；Y轴，细胞计数；
[0020] 图3 :IL23R在肺腺癌细胞系上的表达。通过初级山羊多克隆抗IL23R抗体和PE 标记的抗山羊抗体来检测IL23R表达。实线：IL23R表达；虚线：同种型对照。X轴，PE强 度；Y轴，细胞计数；
[0021] 图4 :IL23R在淋巴瘤/白血病细胞系上的表达。通过初级山羊多克隆抗IL23R抗 体和PE标记的抗山羊抗体来检测IL23R表达。实线：IL23R表达；虚线：同种型对照。X轴， PE强度；Y轴，细胞计数；
[0022] 图5 :通过比对独特⑶R集合，用COBALT的相邻接合算法（Neighbor Joining algorithm)产生的系统发生树；
[0023] 图6 :通过差示扫描荧光测定法确定的PR0165的热展开。温度诱导的蛋白质展开 标准化荧光信号的重复测量结果；和
[0024] 图7 :由PR0165诱导的T细胞驱动DLD-I结肠癌细胞溶解。早期凋亡和坏死DLD-I 细胞的定量；
【具体实施方式】
[0025] 在第一方面，本发明提供一种用于治疗包含IL23R表达性肿瘤细胞的癌症的包含 至少一个第一结合部分和至少一个第二结合部分的双特异性构建体，其中所述第一结合部 分特异性结合细胞毒性效应T(Tc)细胞上存在的第一抗原，并且所述第二结合部分特异性 结合IL-23受体特异性亚单位（IL23R)。
[0026] 在本发明的含义内，术语"构建体"是指任何化学实体，只要它具有所需结合活性 即可。因此，术语"构建体"以最广泛意义使用，并且明确涵盖蛋白质基分子，包括包含一个 或多个抗体基结构域或其结合片段的重组抗体及其片段。特定实例包括但不限于单克隆嵌 合抗体、人源化抗体、单链双功能抗体等。此外，如在本发明内例如联合术语"构建体"使用 的术语"包含"涵盖"包括"与"由…组成"两者。
[0027] 如本文所用的术语"双特异性"意指构建体具有两种不同抗原特异性以及任选结 合它们的相应结合伴侣的其它结合部分，如结合Fc受体的部分或用于检测和/或纯化的标 签。这意味着双特异性构建体能够同时结合至少一种抗原"A"和至少一种抗原"B"，其中A 和B不相同。因此，尽管具有两种不同抗原特异性，但本发明的双特异性构建体未必仅具有 分别针对各靶向抗原的两个结合部分，而是也可包括超过两个的结合部分。此外，如本文所 用的术语"抗原"应以广义解释，并且包括由本发明的双特异性构建体的结合部分结合的任 何靶标部分。
[0028] 如本发明中所用，术语"特异性"或"特异性地"意指第一结合部分和第二结合部 分能够区分它们的相应靶标分子（即区分第一抗原和第二抗原）和/或一种或多种参照分 子。因此，"特异性结合"或"特异性地结合"以它的最广泛意义指代第一结合部分和第二结 合部分能够区分Tc细胞的表面上的第一抗原和靶标细胞的表面上的IL23R第二抗原和/ 或与第一抗原和/或第二抗原（即IL23R)相关或不相关的其它靶标分子。
[0029] 可如本领域中所知使用例如表面等离子体共振（SPR)、蛋白质印迹（western blot)、酶联免疫吸附测定（ELISA)、放射免疫测定（RIA或IRMA)、增强化学发光（ECL)和肽 扫描分析来测定特异性结合部分的结合特异性。
[0030] 如果使用ELISA测定，那么可借助于例如采用HRP、H202、四甲基联苯胺系统，通过 使用辣根过氧化物酶（HRP)缀合的第二抗体进行的标准显色反应进行评分。反应容器（例 如孔）中的在给定波长下的显色光密度是结合特异性的量度。典型本底信号（阴性反应） 可为约0. 10D，而阳性反应的典型信号可为约1.0 OD或高于I. 00D，从而导致信噪比是10:1 或高于10:1。通常，使用一组约三种至五种无关生物分子（如奶粉、BSA、转铁蛋白等）而 非仅使用单一参照生物分子进行结合特异性的测定。
[0031] 具体来说，本发明涉及一种用于治疗包含IL23R表达性肿瘤细胞的癌症的方法， 其包括向受试者，特别是人患者施用有效量的本发明的双特异性构建体。
[0032] 术语"有效量"如下所阐述在章节[0085]中定义。通常，有效量的本发明的双特异 性构建体以上述药物组合物的形式施用。适合施用途径包括但不限于表面和胃肠外施用， 具体来说是皮下和静脉内注射。不特定限制施用方案，并且包括例如历经一周、两周或四周 连续输注。
[0033] 待治疗的癌症包括但不限于结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、 胰腺癌、B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤，包括成人T细胞淋巴瘤白血病（ATLL)、急性骨髓淋 巴瘤（AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL)、滤泡性淋巴瘤（FL)、儿科急性成淋巴细胞性 淋巴瘤（B-ALL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL)、间变性大细胞淋巴瘤（ALCL)、T 细胞/自然杀伤细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤（PTCL)。在特定实施方案中，癌症选自结 肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤，如成人T 细胞淋巴瘤白血病（ATLL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL)、间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL)、T细胞/自然杀伤细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤（PTCL)。
[0034] 白介素（IL)-23与IL-12之间的平衡在调控抗肿瘤免疫应答方面起重要作用。 IL-23和IL-12是共用它们的一个结构域（p40)的异二聚细胞因子。尽管已发现由两个 亚单位P35和p40组成的IL-12具有抗肿瘤作用，但由p40和pl9组成的IL-23似乎通过 直接作用于肿瘤细胞以及通过产生肿瘤支持性炎症性微环境的间接机理来促进某些肿瘤 的生长。IL-12驱动对抗肿瘤免疫性至关重要的IFN-γ产生性Thl细胞的发育（Dunn，G. Ρ·等 2006. Nat. rev. Tmmunol : 6 ;836_848 !Colombo, Μ· Ρ·和 Trinchieri，G. 2002. Cytokine Growth Factor Rev; 13:155-168)。IL-12和IFN-γ