循环之后，用 IOmM甘氨酸-HCl (pH 2. 0)进行1分钟注射来再生表面。用MASS-I分析软件（Analyzer， Sierra Sensors)，使用一对一朗缪尔结合模型计算表观解离（kd)和缔合（ka)速率常数以 及表观解离平衡常数（KD)。
[0140] 6. scDb介导的通过细胞毒性T细胞来溶解IL-23R表达性细胞
[0141] 对于评估双特异性抗⑶3XIL-23R scDb诱导靶标细胞溶解的潜力，使用人 IL-23R表达性细胞系。结肠癌DLD-I或SW480以及红白血病TF-I用作靶标细胞系。如 上所述分离的未刺激人CD8+T细胞用作效应细胞。根据制造商说明书用细胞毒性绿染料 (Promega)标记革巴标细胞。通过CellTox?绿细胞毒性测定（Promega)来监测细胞溶解。 测定测量由于细胞死亡而发生的膜完整性变化。测定使用被从活细胞排除，但优先染色死 细胞的不对称花青染料。当染料结合受损害的细胞中的DNA时，它的荧光性质被实质上增 强。活细胞不产生可感知的荧光增加。因此，通过与死细胞DNA的结合相互作用产生的荧 光信号与细胞毒性成比例。类似地如上所述，使标记的IL-23R细胞（5' 000个细胞/孔） 与CD8+细胞毒性T细胞在效应物：靶标比率40:1下，在3倍连续稀释的scDb (起始浓度 180nM)存在下，在96孔微量滴定板中一起孵育。为评估不表达靶标的细胞的不特异性溶 解，使T细胞与标记的野生型CHO细胞一起共同孵育。在孵育48小时之后使用多模式微板 读取器（FlexStation 3, Molecular Devices)分析焚光强度。利用 _S:GftMax€)_ Pro 数据 分析软件（Molecular Devices)，使用四参数逻辑曲线拟合来分析数据，并且由剂量-应答 曲线获得为诱导半数最大靶标细胞溶解所需的scDb的摩尔浓度（ECJ。
[0142] 为特定追踪靶标细胞的命运，根据制造商说明书用5nM浓度CeIIVue a Claret远 红外荧光（Sigma-Aldrich，目录号MINCLARET-1KT)染料染色靶标细胞。根据制造商说明 书使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒FITC(eBioscience，目录号88-8005-74)(染料浓度： lOOyL/mL膜联蛋白V和2yg/mL碘化丙啶）监测凋亡/坏死。使染色的IL-23R细胞 (5'000个细胞/孔）与CD8+细胞毒性T细胞在效应物：靶标比率40:1下，在连续稀释的 scDb (起始浓度180nM)存在下，在96孔微量滴定板中一起孵育。为评估不表达靶标的细 胞的不特异性溶解，使T细胞与标记的CHO细胞一起共同孵育。在孵育48小时之后使用流 式细胞仪（FACS aria III，Becton Dickinson)分析荧光强度。通过使用远红外荧光染料 ( CeUVue" Claret远红外荧光）鉴别靶标细胞与效应细胞来分析数据。通过膜联蛋白V 和PI荧光来将靶标细胞门控成活细胞和早期/晚期凋亡、坏死细胞。利用SoftMaxv Pro 数据分析软件（Molecular Devices)，使用四参数逻辑曲线拟合来分析所得数据，并且由剂 量-应答曲线获得为诱导半数最大靶标细胞溶解所需的scDb的摩尔浓度（EC50)。
[0143] 7. scDb构建体的构建体设计和制造
[0144] 通过以VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA构造安置可变结构域来设计单链双功能抗体 构建体。在这些构建体中，VLA和VHA结构域共同形成IL23R的结合位点，而VLB和VHB结 构域共同形成⑶3 ε的结合位点。连接可变结构域的肽连接体L1-L3由甘氨酸/丝氨酸 重复序列构建。两个短连接体Ll和L3由单一 G4S重复序列组成，而长连接体L2由序列 (G4S)4组成。重新合成编码各种抗IL23RX⑶Ε3 ε scDb构建体的核苷酸序列，并且克隆至 适于大肠杆菌表达的基于pET26b(+)骨架（Novagen)的载体中。
[0145] 将表达构建体转化至大肠杆菌菌株BL12(DE3) (Novagen)中，并且在2YT培养基 (Sambrook，J·，等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual)中培养细胞作为起始培 养物。接种表达培养物，并且在37°C和200rpm下在振荡烧瓶中孵育。一旦0D600nm达 到1，即通过在最终浓度0. 5mM下添加 IPTG来诱导蛋白质表达。在过夜表达之后，通过在 4000g下离心来收集细胞。对于制备包涵体，将细胞集结粒再混悬于IB再混悬缓冲液（50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、100mM NaCl、5mM EDTA、0. 5% 曲通（Triton)X-IOO)中。细胞浆液被补充 以ImM DTT、0. lmg/mL溶菌酶、IOmM亮肽素 、100μΜ PMSF和1 μΜ抑肽素。通过在冰上冷却 下进行3个超声均质化循环来使细胞溶解。随后，添加0.0 lmg/mL DNA酶，并且在室温下孵 育匀浆20分钟。通过在15000g和4°C下离心来使包涵体沉积。将IB再混悬于IB再混悬 缓冲液中，并且通过超声处理来均质化，随后再进行离心。总计用IB再混悬缓冲液进行最 少3次洗涤步骤，随后用IB洗涤缓冲液（50mM Tris-HCUpH 7. 5)、100mM NaCl、5mM EDTA) 进行2次洗涤以产生最终IB。
[0146] 对于蛋白质再折叠，以每克湿IB 5mL的比率将分离的IB再混悬于溶解缓冲 液（IOOmM Tris/HCl(pH 8. 0)、6M Gdn-HCl、2mM EDTA)中。在室温下孵育溶解混合物 30 分钟，直至在最终浓度20mM下添加 DTT，并且再继续孵育30分钟。在完成溶解之后，通 过在21500g和4°C下离心10分钟来使溶液澄清。通过在再折叠缓冲液（通常：100mM Tris-HCKpH 8. 0)、5. OM脲、5mM半胱氨酸、ImM胱胺酸）中，在0. 3g/L最终蛋白质浓度的溶 解蛋白质下快速稀释来进行再折叠。通常孵育再折叠反应最少14小时。通过在8500g和 4°C下离心10分钟来使所得蛋白质溶液澄清。通过在Capto L树脂（GE Healthcare)上进 行亲和色谱，随后在Superdex 75柱（GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱来纯化再折叠 蛋白质。将蛋白质配制于天然缓冲液（50mM梓檬酸盐-磷酸盐（pH 6.4)、150mM NaCl)中。 通过尺寸排阻HPLC、SDS-PAGE (针对纯度）和UV/Vis光谱法（针对蛋白质含量）分析分离 的单体洗脱份。
[0147] PR0165 :VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA 的序列表
[0148]
【主权项】
1. 一种用于治疗包含IL23R表达性肿瘤细胞的癌症的双特异性构建体，所述双特异 性构建体包含至少一个第一结合部分和至少一个第二结合部分，其中所述第一结合部分特 异性结合细胞毒性效应T(Tc)细胞上存在的第一抗原，并且所述第二结合部分特异性结合 IL-23受体特异性亚单位（IL23R)。2. -种包含至少一个第一结合部分和至少一个第二结合部分的双特异性构建体，其中 所述第一结合部分特异性结合细胞毒性效应T(Tc)细胞上存在的第一抗原，并且所述第二 结合部分特异性结合靶标细胞的表面上存在的IL-23受体特异性亚单位（IL23R)，具体来 说其中所述靶标细胞是病原性细胞，具体来说是选自由以下组成的组的细胞：IL_17产生 性T细胞（Thl7细胞）、γδΤ细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、恒定性自然杀伤（iNK)细胞和 IL23R表达性肿瘤细胞，更具体来说是Thl7细胞或γδT细胞或IL23R表达性肿瘤细胞。3. 如权利要求1或2所述的双特异性构建体，其特征在于，所述第一结合部分特异性结 合选自⑶3和⑶28的抗原。4. 如权利要求1至3中任一项所述的双特异性构建体，其特征在于，所述第一结合部分 特异性结合CD3,具体来说CD3的ε链（CD3ε)，更具体来说CD3ε的激动性表位。5. 如权利要求1至4中任一项所述的双特异性构建体，其特征在于，所述构建体允许通 过所述Tc细胞高效杀灭所述靶标细胞，和/或其中所述Tc细胞是刺激的Tc细胞或未刺激 的Tc细胞。6. 如权利要求1至5中任一项所述的双特异性构建体，其特征在于，所述第一结合部分 和所述第二结合部分以所述第一结合部分的识别所述第一抗原的部分和所述第二结合部 分的识别IL23R突出的部分相对于所述双特异性构建体的中心，以基本上相反方向向外突 出的方式相对于彼此安置。7. 如权利要求1至6中任一项所述的双特异性构建体，其特征在于，所述第一结合部分 和/或所述第二结合部分是抗体基结合部分，具体来说是包含重链可变结构域（VH)或其结 合片段的抗体基结合部分，更具体来说是包含重链可变结构域（VH)或其结合片段和轻链可 变结构域（\)或其结合片段的抗体基结合部分。8. 如权利要求7所述的双特异性构建体，其是选自由以下组成的组的抗体形 式：单链双功能抗体（scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚 scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞衔接物（BiTE;串联二scFv)、串联三scFv、三功能抗体、 双特异性Fab2、二小型抗体、四功能抗体、scFv-Fc-scFv融合物、二双功能抗体、DVD-Ig、 IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2_Fc、IgG-scFv融合物一所述IgG-scFv融合物包括bsAb、 BslAb、Bs2Ab、Bs3Ab、TslAb、Ts2Ab，以及钮入孔物（KiH)和双体，具体来说是单链双功能抗 体（scDb)，并且更具体来说是双特异性单体scDb。9. 如权利要求8所述的双特异性构建体，其特征在于，所述双特异性scDb包含 由连接体LI、L2 和L3 以顺序VhA-L1-\B-L2-VhB-L3-\A、VhA-L1-VhB-L2-\B-L3-\A、 VlA-L卜VlB-L2-VhB-L3-VhA、VlA-L卜VhB-L2-VlB-L3-VhA、VhB-L卜VlA-L2-VhA-L3-VlB、 VhB-L1-VhA-L2-VlA-L3-\B、\B-L1-VlA-L2-VhA-L3-VhB或 \B-L1-VhA-L2-\A-L3-VhB连接的 两个可变重链结构域（VH)或其片段和两个可变轻链结构域<X)或其片段，其中和vha 结构域共同形成所述第一抗原的抗原结合位点，并且和VhB共同形成IL23R的抗原结合 位点，具体来说其中连接体L1是具有2-10个氨基酸的肽，连接体L3是具有1-10个氨基酸 的肽，并且所述连接体L2是具有10-40个氨基酸的肽。10. 如权利要求1至9中任一项所述的双特异性构建体，其特征在于，所述双特异性构 建体是PR0165(SEQIDNO:7)或PR0165的功能活性变体。11. 一种或多种核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性构建体。12. -种或多种载体，其包含根据权利要求11所述的一种或多种核酸。13. -种或多种宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的一种或多种载体。14. 一种用于产生根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性构建体的方法，包括 (i)提供根据权利要求11所述的一种或多种核酸、或根据权利要求12所述的一种或多种载 体，表达所述一种或多种核酸或所述一种或多种载体，以及从表达系统收集所述双特异性 构建体，或（ii)提供根据权利要求13所述的一种或多种宿主细胞，培养所述一种或多种宿 主细胞；以及从细胞培养物收集所述双特异性构建体。15. -种药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性构建体以 及药学上可接受的载体。16. 根据权利要求2至10中任一项所述的双特异性构建体，其用于治疗炎症性和/或 自身免疫疾病，具体来说治疗人患者，具体来说其中所述炎症性和/或自身免疫疾病选自 由以下组成的组：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、溃疡性结肠 炎、克罗恩氏病、全身性红斑狼疮、青少年糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、以及多发性硬化症、 帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和缺血-再灌注损伤。17. 根据权利要求1所述的双特异性构建体，其用于治疗人患者，具体来说其中所述 癌症选自由以下组成的组：结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、口腔癌、食道癌、胰腺癌、 B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤，包括成人T细胞淋巴瘤白血病（ATLL)、急性骨髓淋巴瘤 (AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL)、滤泡性淋巴瘤（FL)、儿科急性成淋巴细胞性淋巴瘤 (B-ALL)、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL)、间变性大细胞淋巴瘤（ALCL)、T细胞/自 然杀伤细胞淋巴瘤和外周Τ细胞淋巴瘤（PTCL)。18. 根据权利要求17所述的双特异性构建体，其中所述人患者是具有高Thl7应答的患 者。
【专利摘要】本发明涉及特异性结合免疫效应细胞以及同时结合IL23R携带性靶标细胞的双特异性构建体，以及核酸、载体、宿主细胞、药物组合物及其产生和使用方法，包括该双特异性构建体用于治疗炎症性和/或自身免疫疾病和/或癌症的用途。
【IPC分类】C07K16/28
【公开号】CN105408356
【申请号】CN201480026690
【发明人】大卫·乌雷奇, 提·贡德, 塞巴斯蒂安·迈耶
【申请人】努玛有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年5月12日
【公告号】CA2911946A1, EP2994490A1, US20150329637, US20160083473, WO2014180577A1