一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，属于生物领域。
【背景技术】
[0002]青钱柳(Cyclocarya paliurus)为胡桃科青钱柳属乔木植物。现仅存一种，广泛分布于我国广东、广西、福建、台湾、浙江、江苏、安徽、江西、湖南、陕南、四川、云南、贵州等省区的海拔420?2500 m的山区、溪谷或石灰岩山地。青钱柳是我国特有的保健食品资源，其水提物具有生津止渴、清热解暑、降压降脂血糖及增强机体免疫力等多种功效。《中国中药资源志要》记载，其树皮、叶具有清热消肿、止痛的功能，可用于治疗顽癣，长期以来民间用其叶片做茶。研究表明:青钱柳叶含三萜、黄酮、多糖及微量元素等活性成分，具有降糖、调脂、增强免疫等多种生理活性和药理功能，是很好的天然保健食品资源。虽然青钱柳具有很高的开发利用价值，但目前可利用的资源很少，有限的资源零星分布于深山老林之中，或保存于自然保护区内。为了解决资源匮乏问题，科研人员对其繁育难题进行了大量的研究。由于青钱柳是我国特有的资源，国外研究极少，国内研究主要集中于种子萌发和无性繁殖上。青钱柳坚硬的种壳既束缚了种胚且影响透气，种子又属于综合性深休眠类型，自然萌发率低，有性繁育困难，因而种子萌发成为了研究的重点和难点。
[0003]现有技术已经有人试着培养青钱柳悬浮细胞，并研究出了最佳培养条件:适合青钱柳悬浮培养的培养基为:MS+0.1 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+1 mg/L KT+30 g/L蔗糖，接种量为8%，摇瓶装液量的体积分数为40%，初始pH值为5.0。在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值166 g/L ο
[0004]本发明旨在提供一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在一个培养周期内，仅仅第8d就达到青钱柳鲜重达到最大值208-389 g/Lο
【发明内容】
[0005]基于【背景技术】存在的技术问题，本发明针对【背景技术】存在的问题，提供一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在一个培养周期内，第8d青钱柳鲜重达到最大值208-389 g/L ο
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下:
(1)愈伤组织的诱导及继代:
按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第9-11代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织；
(2)制备复方中药提取液:
如下所述均为质量份；
取5-6份黄芪，3-6份淫羊藿，2份党参，3-5份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉；
精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存；
(3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞:
取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ;
所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+5-8 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42 g/L鹿糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0，在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值208-389 g/L ο
[0007]本发明首次将中草药萃取液用于青钱柳悬浮细胞的培养，其效果好，成本低。中草药的配伍既可选择单味药，也可选择多味药组成的复方，但不是一些药物的简单粗制组合，无“法”无“方”无“配伍”，在理论联系实践基础上，考虑到现代药物本身的性能有选择地将药物配伍起来使用，充分发挥药物的整体作用。
[0008]本发明在传统中草药理论的基础上，通过大量实验得到一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在一个培养周期内，第8d青钱柳鲜重达到最大值208-389 g/L。
[0009]本发明的有益之处在于:
(1)本发明利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在一个培养周期内，第8d青钱柳鲜重达到最大值208-389 g/L ο
[0010](2)本发明制得的青钱柳细胞活力很高。
[0011](3)本发明的方法非常简单，仅需要一步就能制得高密度的青钱柳细胞，易于产业化操作。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:
快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下:
(1)愈伤组织的诱导及继代:
按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第9代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织；
(2)制备复方中药提取液:
如下所述均为质量份；
取6份黄芪，3份淫羊藿，2份党参，5份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉；
精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存；
(3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞:
取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ; 所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+5 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42 g/L鹿糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0。
[0013]结果:
在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值389 g/L ο
[0014]细胞活力采用TTC法测定，检测得到的细胞活力为:0.58。
[0015]实施例2:
快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下:
(1)愈伤组织的诱导及继代:
按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第11代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织；
(2)制备复方中药提取液:
如下所述均为质量份；
取5份黄芪，6份淫羊藿，2份党参，3份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉；
精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存；
(3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞:
取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ;
所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+8 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42 g/L鹿糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0。
[0016]结果:
在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值2