08 g/L ο
[0017]细胞活力采用TTC法测定，检测得到的细胞活力为:0.51。
[0018]实施例3:
快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下:
(1)愈伤组织的诱导及继代:
按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第10代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织；
(2)制备复方中药提取液:
如下所述均为质量份；
取6份黄芪，5份淫羊藿，2份党参，4份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉；
精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存； (3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞:
取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ;
所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+6 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42 g/L鹿糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0。
[0019]结果:
在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值300 g/L ο
[0020]细胞活力采用TTC法测定，检测得到的细胞活力为:0.40。
[0021]实施例4:
快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下:
(1)愈伤组织的诱导及继代:
按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第9代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织；
(2)制备复方中药提取液:
如下所述均为质量份；
取5份黄芪，4份淫羊藿，2份党参，5份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉；
精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存；
(3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞:
取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ;
所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+7 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42 g/L鹿糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0。
[0022]结果:
在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值250 g/L ο
[0023]细胞活力采用TTC法测定，检测得到的细胞活力为:0.51。
[0024]实施例5:
快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下:
(1)愈伤组织的诱导及继代:
按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第11代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织；
(2)制备复方中药提取液:
如下所述均为质量份；
取6份黄芪，3份淫羊藿，2份党参，4份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉；
精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存；
(3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞:
取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ;
所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+5 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42 g/L鹿糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0。
[0025]结果:
在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值350 g/L ο
[0026]细胞活力采用TTC法测定，检测得到的细胞活力为:0.38。
[0027]可见，本发明在传统中草药理论的基础上，通过大量实验得到一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其利用多种独特中草药提取物，成本低廉，可以在一个培养周期内，第8d青钱柳鲜重达到最大值223 g/L，细胞活力也很高。
[0028]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于，步骤如下: (1)愈伤组织的诱导及继代: 按照常规进行青钱柳愈伤组织的诱导，然后进行继代培养，在第9-11代时，获得质地松散，生长旺盛稳定的淡黄色愈伤组织； (2)制备复方中药提取液: 如下所述均为质量份； 取5-6份黄芪，3-6份淫羊藿，2份党参，3-5份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至50份水时，将药液冻干为粉； 精确称取lOOmg冻干粉，加入lmLPBS并置于80°C助溶，8000r /min离心10 min，取上清液过滤，分装并_20°C保存； (3)快速高密度培养青钱柳悬浮细胞: 取青钱柳生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中振荡悬浮培养，培养温度26°C，摇床转速为120 r/min ; 所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成:MS+5-8 mg/L复方中药提取液+ 0.05mg/L 2, 4-D+0.6 mg/L ΝΑΑ+0.6 mg/L KT+42g/L蔗糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH值为5.0。2.权利要求1所述的快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法，其特征在于: 在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8 d，青钱柳鲜重达到最大值208-389 g/Lo
【专利摘要】本发明公开了一种快速高密度培养青钱柳悬浮细胞的方法：（1）愈伤组织的诱导及继代；（2）制备复方中药提取液：5-6份黄芪，3-6份淫羊藿，2份党参，3-5份伸筋草，2份天山雪莲，0.6份罗汉果；（3）快速高密度培养青钱柳悬浮细胞：所述青钱柳悬浮培养的培养基由以下组分组成：MS+5-8？mg/L复方中药提取液+0.05？mg/L？2,4-D+0.6？mg/L？NAA+0.6？mg/L？KT+42？g/L？蔗糖，接种量为7%，摇瓶装液量的体积分数为38%，初始pH？值为5.0。在一个培养周期内，悬浮培养的青钱柳细胞的生长曲线呈“S”型，第8？d，青钱柳鲜重达到最大值208-389？g/L。
【IPC分类】C12N5/04, C12N5/02
【公开号】CN105420177
【申请号】CN201510845298
【发明人】谢再法, 姚凤鸣, 郭锋燕
【申请人】浙江拓普药业股份有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月30日