一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及干细胞工程、组织工程与生物起搏等领域，特别是涉及干细胞培养与鉴定技术领域。
技术背景
[0002]极小胚胎样干细胞(verysmall embryonic-like stem cells,VSELs)于2006年由美国肯塔基州路易斯维尔大学M.Ratajczak教授等从小鼠骨髓单个核细胞中成功分离并命名，细胞表型为Sca-l(+)lin(_)⑶45(_)，直径2-4μπι。该团队进一步研究发现人骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等组织中同样存在，细胞表型为SSEA-4+/0ct-4 +/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直径为4-6μπι。人和鼠VSELs的生物学特性主要包括:较血小板大，红细胞小，细胞核大，含常染色质，表达原始多能干细胞标志Oct-4和Nanog，可以向三个胚层分化，且无免疫排异与伦理问题，被认为具有替代胚胎干细胞的潜力。由于VSELs在一般体外培养条件下极易分化且体外很难扩增，甚至引起一些学者的质疑。加州斯坦福大学Wei ssman按照Ratajczak团队最初所描述的方法重复实验并广泛分析，尽管在他的实验中发现这些小细胞，但其并没有像多能干细胞那样，在体外聚集成球，也无法扩增。M.Rata jczak团队研究结果也表明人或鼠的VSELs数量均极少(只占骨髓单个核细胞的0.01%-0.04%)，故即使存在VSELs，其极低的数量级也成为VSELs进入临床的瓶颈。因此，如何改进培养和鉴定技术是VSELs研究中急需解决的问题。另外，迄今为止，尚缺乏大型偶蹄动物VSELs的成功培养与鉴定报道或专利申报。
[0003]经典的培养基有很多种，其中DMEM、F12、RPMI1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的非饲养层培养基，但由于VSELs类似于胚胎干细胞，维持其生长代谢所需的营养须十分充足，因此单纯采用上述培养基体外培养VSELs很难扩增且极易分化。乳猪成肌细胞饲养层以其易于取材、更能模拟体内环境，给成体VSELs提供足够营养并抑分化效果好等特点，优于上述广泛应用的饲养层。
【发明内容】
[0004]因此，针对目前极小胚胎样干细胞培养扩增困难、效率低、易分化、纯度不高，难以鉴定以及迄今为止尚缺乏大型偶蹄类动物VSELs分离、培养与鉴定的报道等突出问题。本发明提供了一种VSELs培养与鉴定方法，为VSELs的进一步研究提供了重要的技术保障。
[0005]猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，技术方案为:将分离、纯化后得到的猪骨髓极小胚胎样干细胞接种于铺有成肌细胞饲养层的培养板中，用RPMI 1640培养基进行培养，置于37°C、5% C02的培养箱中，并添加双抗(青-链霉素储存液)、白血病抑制因子(LIF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子进行培养，每2天更换1次培养液，培养9至11天可以进行传代。
[0006]在本申请提交之前，本课题组已经提交了一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法的发明专利申请，申请号:201510909419.3.，本发明将分离、纯化后得到的极小胚胎样干细胞接种于成肌细胞饲养层加以培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液，3天呈现聚集趋势，至5天形成类似细胞克隆的细胞集落，随着培养时间的增加，细胞集落增大，数量也有所增加，可获得扩增且未分化的极小胚胎样干细胞;而无饲养层组则不能形成类似细胞克隆的细胞集落且10天仍无明显细胞扩增。
[0007]作为本方法的优选，所添加双抗(青-链霉素储存液)是取青、链霉素各100万单位溶于lOOmLPBS缓冲液中。
[0008]作为本方法的优选，所述的成肌细胞饲养层，其制备包括如下步骤:
一是乳猪成肌细胞分离，步骤包括:
将乳猪麻醉后，无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本，用PBS清洗，并尽量剔除表面结缔组织;将骨骼肌组织样本剪成1 mm3的小块置于离心管中，加入lg/L的胶原蛋白酶Π，置于37 °C恒温水浴中消化，20?40分钟后，1200 rpm离心6分钟，弃上清;加入0.25%胰蛋白酶消化液，取上清液加入等体积含有10?15%胎牛血清的DMEM终止消化，剩余组织可重复消化1次;轻轻吹打细胞悬液，尽量吹散细胞，用400目过滤筛过滤，1200 rpm离心6分钟，弃去上清液。用新鲜DMEM液洗2?3次，1200 rpm离心6分钟；用10?15%胎牛血清+ 10%马血清的F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于培养箱中培养;培养1.5?2小时后，将上清液移于另一培养皿中继续培养，以去除非肌原性细胞;培养5?6天，细胞生长至80 %贴壁，可以进行传代;弃去培养基，用PBS清洗细胞3次，加入适量0.25%胰酶消化3?5分钟，用含有10 %胎牛血清的培养基终止消化，1200 rpm离心6分钟，用F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37 °C，5 % C02培养箱中继续培养;40分钟后，将上清液移于另一培养皿中继续培养。
二是乳猪成肌细胞饲养层制备，步骤包括:
将传至3代细胞的培养基吸出，加入适量丝裂霉素C，培养1?2小时后，弃去丝裂霉素C溶液，用清洗7?8次，加入适量0.25%胰酶消化液消化3?5分钟，用含有10 %胎牛血清的培养基终止消化，1200 rpm离心6分钟，用培养基重悬清洗细胞2次，1200 rpm离心6分钟，培养基重悬细胞，接种于96孔板中，置于培养箱中培养;观察到细胞融合至60 %左右，即获得成肌细胞饲养层。
[0009]作为本方法的进一步优选，所选取用于麻醉的为出生2-4天的乳猪，雌雄不限，由扬州大学实验动物中心提供，所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。实验方案获得扬州大学实验动物伦理委员会和江苏省苏北人民医院伦理委员会批准。
[0010]作为本方法的进一步优选，上述所用的0.25%胰蛋白酶，是将0.25g胰蛋白酶溶于lOOmLPBS缓冲液中，调整PH值至7.2，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于_20°C环境中，常温下应用。
[0011]作为本方法的进一步优选，所应用到的PBS缓冲液(不含Ca、Mg)，是取Na2HP04.12H20 1.4425g，KH2P04 0.1g，NaCl 4g，KCl 0.lg，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，保存在4°C环境中。
[0012]本发明同时提供了3种方法鉴定分离或培养的猪VSELs。具体为:
1、透射电镜鉴定猪VSELs的方法，步骤包括:将分离或培养后的⑶45 (-) CD133 ( + )lin (-)的单核细胞和骨髓间充质干细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构。
[0013]2、免疫荧光鉴定猪VSELs的方法，步骤包括:将分离或培养后的VSELs培养液从培养孔板中吸出，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS润洗3次;0.2% Triton X -100透膜处理20min，PBS润洗3次;含10% FBS的封闭2 h;分别在不同孔中加一抗SSEA_1、S0X_2、0CT-4、NAN0G，4°C冰箱过夜;过夜细胞孵育后，分别加入相对应的二抗;添加0.5%Tween 20的roS溶液(PBS-T)润洗3次，每次5min，滴加二抗，37°C温育2 h(避光);PBS-T润洗3次，每次5min；5ng/yL DAPI常温下染色2 min;荧光显微镜观察;碱性磷酸酶(AKP)染色将荧光染色后的细胞孔板中的培养液吸出，加入配置好的碱性磷酸酶染色液，放在倒置显微镜下观察。
[0014]3、基因水平鉴定猪VSELs方法，步骤包括:
一是RNA提取。包括先将细胞悬液收集至离心管中，lOOOrpm，6-8min，之后用PBS重悬细胞，重复三遍以达到清洗细胞的目的，按1 X 107细胞加入lmL TRIZ0L试剂；将上述样品于15-30°C(常规室温即可)静置5min，使蛋白质充分解离;加入0.2mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15_30°C静置2_3min;于2_8°C12000rpm离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA;取上清，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于15-30°C静置lOmin后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA;于4°C 12000rpm离心lOmin后，弃上清；向沉淀中加入lmL 75%乙醇，轻轻混勾；于4°C 7500rpm离心5min后，弃上清；将RNA样品瞭干，加入适量去离子甲酰胺溶解(可于55-60°C促溶lOmin);
二是反转录制备cDNA，步骤包括:制备gDNA去除反应体系，将5XgDNA Buffer 2μΚTotal RNA -、RNase_FreeddH20补足至10μ1混合均勾，简短离心，于42°C孵育3min，至于冰上备用；制备反转录反应体系:将 10 XFast RT Buffer 2μKRT Enzyme Mix lyl、FQ-RTPrimer Mix 2μ1、RNase_FreeddH20补足至10μ1混合；将反转录反应体系中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；42°C孵育15min，95°C孵育3min，得到的cDNA用于后续实验，或-20°C保存；
三是荧光定量PCR，步骤包括:建立20 μ?反应体系，将2 X Super Real Pre Mix Plus10μ1、50 XROX Reference Dye _、模板-，正、反向引物各0.6μ1 和RNase-Free ddH20补足至20μ1混合，在室温下平衡并彻底混匀，离心。设置荧光定量检测仪进行检测；建立20 μ?反应体系，将Template <lyl、Primer 1 lpKPrimer 2 1μΚ2XTaq PCR MasterMix 12.5μ 1,RNase-Free ddH20补足至25μ1混合均匀；PCR反应循环的设置:反应条件设置为94°C 3min、94°C 30 sec、56°C 15 sec、72°C 30 sec、72°C 5 min，以上反应条件进行34 个循环；琼脂糖凝胶电泳检测成肌细